前房相關(guān)免疫偏離中CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相關(guān)研究.pdf

1、多種抗原(如可溶性蛋白抗原、病毒編碼的蛋白抗原及次要組織相容性抗原等)被注射入前房后，能誘導(dǎo)出一種全身性的免疫反應(yīng)偏離，稱(chēng)為前房相關(guān)免疫偏離(anterior chamber associated immune deviation，ACAID)。其特點(diǎn)為抗原特異性的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity,DTH)缺如、細(xì)胞毒T細(xì)胞前體細(xì)胞克隆擴(kuò)增以及非補(bǔ)體結(jié)合性抗體水平增加。ACAID能保護(hù)眼部免受抗

2、原特異性免疫反應(yīng)的損傷。 在ACAID的形成過(guò)程中至少存在兩類(lèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，一類(lèi)是抑制DTH反應(yīng)形成的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，另一類(lèi)是抑制DTH反應(yīng)表達(dá)的CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。近年來(lái)，隨著對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性的標(biāo)志分子。但研究大都集中于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，而且Foxp3亦主要表達(dá)于CD4+CD25+Tr。最近，研究逐漸發(fā)現(xiàn)在人與嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型體內(nèi)存在CD8+Tr，并提出F

3、oxp3在其中的表達(dá)。 此外，TGF-β1及IL-10是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最主要的兩種效應(yīng)性細(xì)胞因子。TGF-β對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)形成及其在外周的維持均有重要的作用。以往對(duì)于ACAID的研究也發(fā)現(xiàn)這兩類(lèi)細(xì)胞因子是ACAID形成不可缺少的。但是，對(duì)于ACAID中CD8+Tr是否通過(guò)它們發(fā)揮抑制作用尚不十分清楚。 本課題首先將OVA注射至小鼠眼前房誘導(dǎo)出ACAID動(dòng)物模型，并用正常小鼠及前房注射PBS的小鼠作為對(duì)照，通過(guò)局部過(guò)

4、繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ACAID小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞具有抑制功能；其次應(yīng)用FCM及RT-PCR檢測(cè)ACAID小鼠脾臟細(xì)胞刺激前后CD8+T細(xì)胞中Foxp3在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)；最后應(yīng)用ELISA分析了ACAID小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞分泌TGF-β1及IL-10的水平，并進(jìn)一步通過(guò)抗TGF-β1阻斷抗體證實(shí)了這群CD8+Tr以分泌TGF-β1發(fā)揮抑制功能。為進(jìn)一步闡明ACAID中CD8+Tr的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本課題的研究主要

5、分為以下三部分： 第一部分 ACAID模型的建立及ACAID中CD8+T細(xì)胞抑制功能的測(cè)定。 目的:通過(guò)前房注射OVA來(lái)誘導(dǎo)ACAID，為實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的動(dòng)物模型。并證實(shí)ACAID小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞的抑制功能。 方法: (1) 采用乙醚吸入法麻醉C57BL/6小鼠，在手術(shù)顯微鏡下用玻璃微量注射針將5ul OVA(20mg/ml)溶液注入小鼠眼前房；前房注射后第14天于小鼠后足墊內(nèi)皮下注射100u

6、l OVA(2.5mg/ml)溶液與等體積完全弗氏佐劑的混懸液，總體積為0.2ml；7天后于小鼠右耳廓皮內(nèi)注射20ul OVA(20mg/ml)溶液，左耳廓皮內(nèi)注射相同劑量的無(wú)菌PBS溶液，24小時(shí)后檢測(cè)DTH反應(yīng)，以評(píng)價(jià)ACAID是否形成。 (2)采用局部過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)測(cè)定CD8+T細(xì)胞的抑制功能。磁珠分選ACAID小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞，與皮下免疫小鼠的脾臟細(xì)胞按1∶1混合重懸于10mg/mlOVA溶液中；取20ul細(xì)胞混懸

7、液皮內(nèi)注射至正常小鼠右耳廓內(nèi)，左耳廓皮內(nèi)注射相同劑量的OVA(10mg/ml)溶液，注射前及注射后24小時(shí)檢測(cè)耳廓腫脹程度。 結(jié)果: (1) DTH檢測(cè)結(jié)果顯示，ACAID組小鼠的耳廓腫脹度與陰性對(duì)照組相當(dāng)，較陽(yáng)性對(duì)照組小鼠低，存在非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，即ACAID組中DTH反應(yīng)受抑制。 (2)從ACAID小鼠脾細(xì)胞中分選出的CD8+T細(xì)胞能抑制由皮下免疫小鼠脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞所引起的小鼠耳廓的

8、腫脹反應(yīng)。其腫脹程度與陰性對(duì)照組相當(dāng)，較陽(yáng)性對(duì)照組低，存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05=。 結(jié)論:通過(guò)檢測(cè)DTH反應(yīng)表明，前房注射OVA抗原能成功誘導(dǎo)出ACAID；ACAID小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞具有抑制功能。這為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 ACAID小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)。 目的:檢測(cè)ACAID小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞中Foxp3在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。 方法:使用流

9、式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)正常組、ACAID組及前房注射PBS對(duì)照(PBS-AC)組各組脾臟細(xì)胞未刺激及分別經(jīng)多克隆刺激或抗原特異性刺激后CD8+Foxp3+T細(xì)胞的比例；使用RT-PCR分析各組小鼠脾臟cD8+細(xì)胞未刺激及分別經(jīng)多克隆刺激和OVA刺激后Foxp3在mRNA水平的表達(dá)。 結(jié)果:FCM結(jié)果顯示，ACAID小鼠的脾臟細(xì)胞經(jīng)多克隆刺激或特異性刺激后，其中CD8+Foxp3+細(xì)胞的比例均增加；而ACAID小鼠脾臟CD8+T細(xì)

10、胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)僅在多克隆刺激后增加。 結(jié)論:在ACAID形成時(shí)，脾臟CD8+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3增加，提示cD8+Foxp3+T細(xì)胞可能與這一免疫耐受的形成有關(guān)。 第三部分 ACAID小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌及相關(guān)功能的研究 目的:檢測(cè)ACAID小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞分泌TGF-β1及IL-10的情況，并進(jìn)一步探討這群CD8+T細(xì)胞是否通過(guò)分泌TGF-β1或IL-10發(fā)揮抑制功能。

11、 方法:使用ELISA檢測(cè)．ACAID中CD8+T細(xì)胞分泌TGF-β1及IL-10的水平；在局部過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中使用抗TGF-β1阻斷抗體測(cè)定TGF-β1在其中的作用。 結(jié)果:ACAID小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞能以抗原特異性的方式分泌TGF-β1；在局部過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，抗TGF-β1阻斷抗體能阻斷ACAID中傳出性CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能。 結(jié)論:ACAID中的CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)分泌TGF-β1發(fā)揮其

12、抑制功能。 小結(jié) 本課題研究發(fā)現(xiàn)，將OVA注射至小鼠眼前房能誘導(dǎo)出ACAID；ACAID小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞具有抑制功能，在局部過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中能抑制DTH反應(yīng)的表達(dá)；ACAID小鼠脾臟細(xì)胞在體外經(jīng)多克隆刺激后，其CD8+T細(xì)胞上Foxp3的表達(dá)在蛋白水平及mRNA水平均增加，而用OVA在體外刺激ACAID小鼠脾臟細(xì)胞，其中CD8+T細(xì)胞上Foxp3的蛋白水平表達(dá)增加；ACAID小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞能分泌大量的TGF