調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與肝癌預(yù)后的相關(guān)性研究.pdf

1、1.背景與目的: 目前盡管過(guò)繼免疫治療對(duì)某些腫瘤如惡性黑色素瘤、腎癌等顯示出一定的療效，但在其他大部分腫瘤包括肝癌的治療中效果不理想，其原因可能與腫瘤抗原的免疫原性較弱、缺乏共刺激因子、體外培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞活性下降等有關(guān)。近年的研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)對(duì)其他效應(yīng)細(xì)胞的免疫抑制，也是影響過(guò)繼免疫治療效果的重要原因之一。Treg細(xì)胞來(lái)源于胸腺，也可以在外周淋巴組織中由特異性抗原或者抑制性細(xì)

2、胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，它表達(dá)CD4、CD25、FOXP3、CTLA-4、GITR等多個(gè)分子。研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、乳腺癌、卵巢癌等患者外周血或者腫瘤組織中Treg數(shù)量增多，而且Treg增多提示患者的預(yù)后差。但關(guān)于Treg在肝癌外周血和組織中的水平及其對(duì)預(yù)后的影響少見(jiàn)有報(bào)道。 本研究將探討肝癌患者外周血中Treg/CD4+T比例、肝癌組織中Treg分布、數(shù)量及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，闡明Treg在肝癌臨床中的意義，為進(jìn)一步開(kāi)展肝癌的過(guò)繼

3、免疫治療提供參考。 2.病例和方法: 63例肝細(xì)胞性肝癌患者均于1999年1月至2000年12月在中山大學(xué)腫瘤防治中心肝膽科行根治性手術(shù)切除，治療前均未接受任何抗腫瘤治療和免疫治療，沒(méi)有合并免疫相關(guān)性疾病。其中男性54例(85.7﹪)，女性9例(14.3﹪)；年齡25～72歲，中位年齡53歲。58例合并有慢性乙型肝炎感染(92.1﹪)。按照UICC(2002)的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期15例(23.8﹪)，Ⅱ期46例(73.0﹪)

4、，Ⅲ期2例(3.2﹪)。隨訪截止日期為2005年12月31日，以5年累積生存率和無(wú)瘤生存率作為觀察預(yù)后的指標(biāo)。同時(shí)收集研究對(duì)象的性別、年齡、術(shù)前AFP水平、ICG<,R15>、乙肝感染情況、UICC分期、腫瘤的包膜、大小、肝硬化程度、癌細(xì)胞分化程度一共10項(xiàng)臨床病理特征的相關(guān)資料。20例慢性乙型肝炎感染者、40例健康獻(xiàn)血者的外周血分別作為肝炎對(duì)照組和正常對(duì)照組。10例肝炎組織、10例因肝臟良性病變(肝血管瘤6例，F(xiàn)NH4例)行手術(shù)切除的

5、標(biāo)本周?chē)母谓M織(病理確診為正常肝組織)分別作為肝炎對(duì)照組和正常對(duì)照組。外周血中Treg的表面標(biāo)記選擇為CD4CD25雙陽(yáng)性，腫瘤組織中Treg的標(biāo)記為FOXP3陽(yáng)性。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者手術(shù)前2至3天外周靜脈血Treg及CD4+T細(xì)胞，計(jì)算Treg比例；采用免疫組化方法檢測(cè)腫瘤組織、癌旁肝組織(距離腫瘤邊緣<1cm)中FOXP3的表達(dá)，在光學(xué)顯微鏡下觀察FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞的分布特征，隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(×400)分別計(jì)算腫瘤組織

6、和癌旁肝組織的FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞的總數(shù)并取其平均值作為最終結(jié)果，以FOXP3+細(xì)胞數(shù)量作為組織中Treg的數(shù)量。 分別比較HCC與對(duì)照組外周血、組織中Treg細(xì)胞水平的差異。Mann-WhimeyU檢驗(yàn)比較兩組問(wèn)差異；采用Spearman相關(guān)分析法分別分析外周血和腫瘤組織中Treg細(xì)胞的相關(guān)性、外周血Treg細(xì)胞比例、腫瘤組織中Treg細(xì)胞數(shù)量與各個(gè)臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，Log-rank法檢驗(yàn)單因素對(duì)預(yù)后的影響，Cox多因素回歸

7、模型分析Treg與預(yù)后的關(guān)系，采用SPSS 10.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，雙側(cè)P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。 3.結(jié)果: 3.1 肝癌患者外周血Treg的比例63例肝癌患者外周血中Treg的比例為(12.85±4.82)﹪，20例乙肝患者為(9.21±2.09)﹪，40例正常對(duì)照組為(8.80±1.91)﹪。肝癌患者外周血中Treg的比例顯著高于乙肝患者及正常對(duì)照組(P值均<0.01)；乙肝患者和正

8、常對(duì)照組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.551)。 3.2肝癌組織、癌旁肝組織Treg細(xì)胞的分布情況63例肝癌組織的免疫組化結(jié)果顯示：FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞主要位于腫瘤間質(zhì)內(nèi)，呈巢狀聚集或者散在分布，在癌巢中呈散在分布。腫瘤組織Treg的數(shù)量為(2.50±2.11)/HP，變化范圍為0.2～9.7/HP。在癌旁肝組織、10例肝炎組織、10例正常肝組織中均未見(jiàn)FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞。 3.3 肝癌外周血與組織中Treg的關(guān)系外周血

9、Treg比例與腫瘤組織中Treg數(shù)量呈明顯正相關(guān)(r=0.284，P=0.024)。 3.4 Treg細(xì)胞與臨床病理特征之間的關(guān)系分析外周血Treg比例、肝癌組織中Treg細(xì)胞與患者的性別、年齡，術(shù)前AFP水平、ICG<,R15>，乙肝感染情況，UICC分期，腫瘤包膜、大小、肝硬化程度，癌細(xì)胞分化程度的關(guān)系，結(jié)果提示外周血Treg比例、肝癌組織中Treg細(xì)胞數(shù)量與各個(gè)臨床病理指標(biāo)無(wú)相關(guān)性(P值均大于0.05)。 3.5

10、Treg與預(yù)后的關(guān)系全組病例均獲得隨訪。隨訪期間有43例(68.3﹪)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，36例(57.1﹪)死于腫瘤復(fù)發(fā)，全組1，3，5年累積生存率分別為93.7﹪，63.5﹪，42.9﹪。1，3，5年無(wú)瘤生存率分別為84.1﹪，42.9﹪，31.7﹪。 按照外周血Treg比例是否大于HCC組的均值(12.85﹪)，將病例分為高水平組(Treg比例>12.85﹪，n=37)、低水平組(Treg≤12.85﹪，n=26)，二組5年累積

11、生存率分別為32.4﹪、57.7﹪，其差異有顯著性意義(P=0.020)；5年無(wú)瘤生存率分別為27.0﹪、38.5﹪，其差異無(wú)顯著性意義(P=0.119)。 按照每高倍視野(HP)的腫瘤組織Treg細(xì)胞數(shù)量是否大于3個(gè)，將病例分為高水平組(Treg數(shù)量>3/HP，n=20)、低水平組(Treg數(shù)量≤3/HP，n=43)，其5年累積生存率分別為25.0﹪、51.2﹪，5年無(wú)瘤生存率分別為15.0﹪、39.5﹪，其差異均有顯著性意義

12、(P值分別為0.025、0.009)。 利用Cox回歸模型分析臨床病理指標(biāo)以及外周血Treg比例、肝癌組織中Treg數(shù)量對(duì)預(yù)后的影響。結(jié)果顯示腫瘤是否有包膜、外周血Treg比例、腫瘤組織Treg數(shù)量是影響5年生存率的獨(dú)立因素(P值分別為0.007、0.042、0.019)，腫瘤是否有包膜、腫瘤組織Treg數(shù)量是影響5年無(wú)瘤生存率的獨(dú)立因素(P值分別為0.016、0.001)。 4.結(jié)論: 4.1肝癌患者外周血中T