人CD8+ 記憶性T細(xì)胞功能的表觀遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、記憶性CD8+T細(xì)胞相對于初始CD8+T細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫應(yīng)答功能，表現(xiàn)為當(dāng)遇到相同病原體的再次刺激時，它們可更快速產(chǎn)生效應(yīng)性細(xì)胞因子如顆粒酶B（Granzyme B）、穿孔素（perforin,Pf）和IFN-γ等，更快速地增殖，從而迅速清除病原體，因此記憶性CD8+T細(xì)胞比初始CD8+T細(xì)胞能為機(jī)體提供更強(qiáng)的免疫保護(hù)功能。但是記憶性CD8+T細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)的分子機(jī)制目前仍不清楚。
　　本研究中，我們首先分選出人外周血中的初始

2、和記憶性CD8+T細(xì)胞，并應(yīng)用抗CD3/CD28抗體聯(lián)合刺激4 h和24 h以分別模擬TCR/共刺激信號介導(dǎo)的T細(xì)胞早期活化和晚期活化，并檢測初始和記憶性CD8+T細(xì)胞在靜息以及活化狀態(tài)下的基因表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始和記憶性CD8+T細(xì)胞在靜息及活化后，僅有占總基因數(shù)5-10%的基因在兩群細(xì)胞間的表達(dá)差異倍數(shù)≥3倍。初始和記憶性CD8+T細(xì)胞所差異表達(dá)的基因中，約200個基因僅在活化后的記憶性CD8+T細(xì)胞中相對于靜息狀態(tài)表達(dá)水平明顯升

3、高，而在初始CD8+T細(xì)胞中其表達(dá)升高不明顯。通過Gene Ontology(GO)分析，這部分基因在免疫應(yīng)答，細(xì)胞殺傷等功能上有顯著的富集。其中免疫應(yīng)答相關(guān)的基因除了常規(guī)的CD8+T細(xì)胞效應(yīng)性細(xì)胞因子，還包括很多輔助性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如Il9，Il17f和Il22等。
　　由于在活化后的記憶性CD8+T細(xì)胞中高表達(dá)的免疫應(yīng)答相關(guān)功能基因與免疫記憶應(yīng)答特征存在密切關(guān)系，于是我們選擇了在初始和記憶性CD8+T細(xì)胞之間差異較顯著的

4、一部分基因，并通過定量PCR，ELISA和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了它們的差異表達(dá)情況，同時選擇初始和記憶性CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平接近的Il2作為對照。結(jié)果顯示，所有經(jīng)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證的差異表達(dá)功能基因，如Ifng，Il17f，Il10等，其表達(dá)水平在活化后的記憶性CD8+T細(xì)胞中均顯著高于初始CD8+T細(xì)胞，而且ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測到相應(yīng)基因的蛋白表達(dá)水平在記憶性CD8+T細(xì)胞中也顯著高于初始CD8+T細(xì)胞。
　　我們進(jìn)一步檢測了

5、重要基因位點(diǎn)組蛋白H3 K9K14的乙?；?。在Ifng基因啟動子靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的區(qū)域，人記憶性CD8+T細(xì)胞組蛋白H3 K9K14的乙?；皆陟o息和活化狀態(tài)下均顯著高于初始CD8+T細(xì)胞，而Il2基因位點(diǎn)組蛋白H3的乙?；絼t沒有明顯差異。同時我們發(fā)現(xiàn)p300在記憶性CD8+T細(xì)胞中Ifng基因位點(diǎn)的富集程度高于初始CD8+T細(xì)胞，而Il2基因位點(diǎn)p300在活化后的初始和記憶性CD8+T細(xì)胞間的富集程度沒有差異。突變Ifng基因啟

6、動子區(qū)p300的結(jié)合位點(diǎn)則降低Ifng啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　我們還通過流式細(xì)胞術(shù)從單個細(xì)胞水平檢測了人初始和記憶性CD8+T細(xì)胞整體水平的組蛋白H3乙?；?。結(jié)果表明靜息狀態(tài)下初始CD8+T細(xì)胞整體水平組蛋白乙酰化高于記憶性CD8+T細(xì)胞，活化后初始和記憶性CD8+T細(xì)胞整體組蛋白乙?；奖褥o息狀態(tài)都有升高，但記憶性CD8+T細(xì)胞較初始CD8+T細(xì)胞升高更為顯著，使得活化后的初始和記憶性CD8+T細(xì)胞整體水平的組蛋白H3乙?；?/p>

7、平?jīng)]有顯著差異。與之對應(yīng)，初始和記憶性CD8+T細(xì)胞之間所有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；傅谋磉_(dá)水平都沒有很大的差異。
　　綜上所述：人初始和記憶性CD8+T細(xì)胞無論是在靜息狀態(tài)，還是活化狀態(tài)，兩者在基因表達(dá)上都存在著差異。其中，和記憶性CD8+T細(xì)胞功能密切相關(guān)的Ifng基因在記憶性CD8+T細(xì)胞活化后顯著升高，并與其轉(zhuǎn)錄區(qū)組蛋白H3的乙?；皆龈呙芮邢嚓P(guān)，而細(xì)胞整體水平的組蛋白乙酰化在活化后的初始和記憶性CD8+T細(xì)胞