慢性乙型肝炎病毒感染對外周血αβT細胞受體β鏈CDR3譜型的影響.pdf

1、背景 乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一個全球性公共衛(wèi)生問題。流行病學資料表明全世界約20億人感染過乙型肝炎病毒。其中約3.5億感染者為慢性HBV感染。近年來隨著HBV轉基因鼠模型的建立，已初步證明HBV抗原誘導的細胞免疫應答參與HBV感染引起的肝細胞損傷過程，并認為慢性HBV感染者細胞免疫功能低下是病毒持續(xù)存在及炎癥反復活動的主要原因。但是目前所得數據中，關于T細胞功能及特異性T細胞頻數的研究較多，

2、直接針對慢性乙型肝炎患者不同階段及慢性無癥狀HBV攜帶者T細胞分子結構特征的研究信息并不多。尤其是關于病毒載量浮動、抗原濃度變化對機體T細胞分子結構特征的影響了解更少。 目的 1.通過調查慢性無癥狀HBV攜帶者外周血T細胞受體譜型的漂移情況，了解T細胞免疫在其病程中的作用，并探討T細胞免疫對于慢性無癥狀HBV攜帶者免疫耐受形成機制的影響。 2.通過分析慢性乙型病毒性肝炎(chronichepatitisB，CHB

3、)炎癥明顯活動期患者T細胞受體(Tcellreceptor,TCR)互補決定區(qū)(complementaritiesdeterminingregion，CDR)3譜型的改變，從整體上了解患者T細胞免疫狀態(tài)，并結合酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT)檢測PBMC中HBcAg特異的rIFN分泌細胞數量變化，試圖探討CHB患者肝臟炎癥與T細胞免疫應答、T細胞CDR3譜系漂移的關系。

4、 3.通過對CHB患者抗病毒(拉米夫定)治療前后外周血T細胞TCRCDR3譜型進行比較，試圖了解患者在病毒學應答前后其T細胞免疫應答的變化，進一步判斷慢性乙型肝炎T細胞免疫是否在病毒載量下降時有所恢復，為制訂CHB的抗病毒治療策略提供理論依據。 4.如果慢性HBV感染后不同個體出現單或寡克隆性增生的T細胞克隆，我們將試圖對其TCRCDR3區(qū)進行基因測序，然后利用分子生物信息軟件比較其核苷酸及氨基酸序列，了解克隆性增生的T細胞是否

5、具有均一性，并模擬出其TCR可變區(qū)三維空間構型，進一步探討其TCRCDR3空間結構有無相似性，以期為進一步尋找新的HBV抗原表位奠定基礎。 方法 1.設計并合成人αβT細胞TCR24個BV(TCRβchainvariablegene，TCRBV)家族的上游引物和共用的TCRBC(TCRβchainconstantgene，TCRBC)下游引物(FAM標記)；在人TCRBC基因中合成實驗對照的TCRBC1、TCRBC2上游

6、引物。 2.PCR擴增后，將標有FAM熒光的PCR產物在全自動測序儀及6％聚丙烯酰氨變性測序膠上電泳。電泳過程應用GeneScan軟件掃描記錄相關信息并進行數據分析，了解TCRαβT細胞CDR3多態(tài)性和長度分布，從而判斷每個BV家族CDR3譜型的漂移情況及單/寡克隆性增生情況。 3.依據TCRCDR3譜型分析結果，如有克隆性增生家族存在，則選取部分單/寡克隆增生的TCRBV家族PCR產物直接進行基因測序，利用分子生物信息

7、學軟件DNAtools6.0及VectorNTISuite8.0分析CDR3區(qū)的序列。 4.采用CPHmodels2.0Serve和IMGT數據庫對克隆增生T細胞TCRCDR3可變區(qū)進行三維空間構型模擬，并根據空間結構判斷各克隆性增生T細胞之間TCRCDR3區(qū)空間結構有無相似性，進一步推測克隆增生T細胞的均一性。 5.慢性無癥狀HBV攜帶者及CHB患者PBMC中HBcAg特異的rIFN分泌細胞數檢測應用ELISPOT技術

8、完成，具體按試劑盒說明操作。 結果 1.4例正常人PBMC中TCR24個BV家族CDR3譜型分析的RT-PCR產物，在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳圖上顯示一條模糊的條帶；在6％的聚丙烯酰氨測序膠電泳圖上，各TCRBV家族均顯示8條以上的條帶 2.9例慢性無癥狀HBV攜帶者外周血TCRBV家族CDR3譜系的RT-PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳時，24個BV家族均可見一條模糊的條帶。6％的聚丙烯酰胺測序膠上電泳時，

9、多數BV家族可見中間信號強兩邊弱的多個熒光條帶。部分家族呈現單一或兩條較亮的條帶；部分家族呈現非正態(tài)分布的多條亮帶；個別家族沒有收到熒光信號。 3.8例炎癥活動期的慢性乙型病毒性肝炎患者及4例接受拉米夫定抗病毒治療的慢性乙肝患者外周血TCR各BV家族經RT-PCR擴增后，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳時，24個BV家族同樣也可見模糊的條帶；在6％的聚丙烯酰胺測序膠電泳圖上，多數TCRBV家族顯示8條以上條帶，部分家族顯示少于8條帶或

10、熒光條帶缺失。 4.依據相對熒光密度判斷，4例CHB接受拉米夫定治療前，各病例24個BV家族譜型偏移率分別是29.2％(病例1)、37.5％(病例4)、50.0％(病例3)及41.6％(病例2)，均數為(x)±SD=39.750±8.655。 5.雖然治療前后的譜型偏移率沒有明顯的改變，但通過對各家族治療前后的譜型分析可以看出，4例CHB患者的一些BV家族的TCRCDR3譜型在治療前后發(fā)生了較大變化：部分BV家族治療前為

11、單克隆性增生譜型，治療后恢復為正態(tài)分布的譜型；部分治療前為多克隆正態(tài)分布譜型，而治療后出現了單/寡克隆性增生。 6.利用CPHmodels2.0Serve和IMGT數據庫，對8例慢性乙型肝炎炎癥活動期患者及4例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定治療前后測得的克隆增生T細胞TCRCDR3區(qū)的蛋白三維空間結構進行了模擬。 7.為進一步了解慢性乙型肝炎抗病毒治療后外周血中出現的克隆性增生T細胞的機制，我們采用下列兩種方法進行了深入研

12、究。 結論 1.通過TCRCDR3譜型掃描分析，了解到慢性無癥狀HBV攜帶者外周血TCRCDR3譜型存在明顯受限，提示細胞免疫參與了其病變過程。另外ELISPOT檢測結果提示慢性無癥狀HBV攜帶者HBcAg特異的rIFN分泌細胞數量與正常對照無差別(P＞0.05)。這些結果進一步提示克隆性增生的T細胞可能與慢性無癥狀HBV攜帶者免疫耐受形成有關。 2.慢性乙型肝炎炎癥活動期患者的T細胞譜型分析同樣證實其外周血TC

13、RCDR3譜型發(fā)生了偏移，且所觀察到的每個病例均有BV家族呈現單/寡克隆性增生。ELISPOT檢測結果提示慢性乙型肝炎HBcAg特異的rIFN分泌細胞數量與正常對照及無癥狀病毒攜帶者相比明顯較高(P＜0.05)，提示CHB患者炎癥活動期克隆性增生T細胞可能以CTL為主及T細胞免疫在肝臟炎癥病理中發(fā)揮著重要作用?？寺≡錾腡細胞TCRCDR3序列測定提示增生的T細胞不具有均一性，進一步提示CHB患者炎癥活動期T細胞免疫應答是多克隆性的。這

14、與慢性乙型肝炎非活動期T細胞免疫識別較單一抗原表位存在較大差別。 3.通過對慢性乙型肝炎拉米夫定(Lamivudine)抗病毒治療前后TCRCDR3譜型分析，我們可以得出如下結論：①在拉米夫定抗病毒治療后，患者外周血總的TCRCDR3譜型偏移率改變不大，可能與抗病毒治療后病毒抗原消失時間較短，或一些抗原在短時間內未完全消失有關。②在拉米夫定抗病毒治療后，部分TCRBV家族CDR3譜型發(fā)生了較明顯的改變：一部分BV家族原來的受限譜

15、型恢復至正態(tài)分布；一些BV家族由原來的正態(tài)譜型轉變?yōu)閱?寡克隆性增生或明顯受限譜型。這一結果提示隨著抗病毒治療取得良好應答，細胞免疫應答也發(fā)生了較大的變化，原來活化的T細胞克隆隨病毒抗原表位消失而失去刺激，最后自行消失。另一方面高載量病毒或高濃度的病毒抗原誘導的部分特異性T細胞克隆耗竭可能隨著抗病毒治療取得良好應答，病毒抗原的下降，使得T細胞克隆重新得以活化。這些克隆增生的T細胞可能與慢性乙型肝炎抗病毒治療的應答存在著關系。③治療前后T

16、CRCDR3譜型的變化在一定程度上提示：TCRCDR3免疫掃描分析找到的克隆增生的T淋巴細胞可能是HBV抗原特異性的，進一步說明免疫譜型分析技術是評價抗原選擇性克隆增生的有效方法之一。④TCRCDR3序列分析及TCR可變區(qū)三維結構模擬進一步證實治療前后克隆性增生的T細胞并非由同一抗原表位引起的，進一步提示抗病毒治療細胞免疫發(fā)生的變化。總之這一結果對我們制訂慢性乙型肝炎抗病毒策略可能會有所啟示。 4.通過PCR及克隆測序證實CHB