過山楓醇提物抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥理作用及相關(guān)機理研究.pdf

1、目的：通過對過山楓乙醇提取物對大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型的實驗研究，探討過山楓治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥理作用機制和進行安全性評估，為下一步新藥開發(fā)研究提供依據(jù)。 方法：首先制作類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，選用本校實驗動物中心提供的清潔級Wistar大鼠，130-170g。實驗前置動物于實驗室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境三天，室溫18-20℃，相對濕度65％。然后制作Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型：酸溶性Ⅱ型膠原溶于0.05mol/L醋酸，4℃過夜然后于冰浴

2、下滴加等體積完全弗氏佐劑(CFA)研磨均勻制成乳劑使膠原含量為2mg/ml，100μl/只皮下注射大鼠尾根部，第14天以100μl/只的含膠原1mg/ml的CFA再次免疫大鼠。以大鼠后足出現(xiàn)紅腫為起病時間，各組隨機抽取大鼠考察各項指標(biāo)包括檢查體征表現(xiàn)、局部關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查、血液學(xué)檢查、影象學(xué)檢查。 選用過山楓乙醇提取物粉末作為觀察藥物，通過對其抗氧化作用、抗炎癥作用和調(diào)節(jié)免疫等方面的實驗觀察，探討藥物的藥理作用；通

3、過藥物對實驗動物體重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐和臟器變化影響的研究，探討過山楓乙醇提取物的藥物安全性。 1選用實驗大鼠足趾腫脹經(jīng)不同藥物治療情況作為GSF抗炎作用實驗之一。隨機將鼠大鼠分為五組：模型對照組、雷公藤總苷組、GSF醇大組、GSF醇小組、水提物組，按要求分級標(biāo)準(zhǔn)，分別記錄分?jǐn)?shù)，隔天記錄一次。 2選用血清SOD含量作為GSF對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎影響實驗之一。小牛Ⅱ型膠原：膠原50mg溶于0.1m醋酸溶

4、液中25ml，4℃冰箱過夜，然后以CTA等體積混合，研磨成乳劑，其膠原濃度為1mg/ml。大鼠分組同實驗方法1。SOD試劑盒，雷公滕對照組劑量20mg、GSF醇大組劑量5g/kg、GSF醇小組2.5g/kg、GSF水提組5g/kg，測定血清SOD含量，用統(tǒng)計學(xué)方法進行比較。 3選用GSF對免疫性關(guān)節(jié)炎模型大鼠淋巴細胞增殖作用作為GSF抗炎作用實驗之一。宮血對照組、雷公藤組、GSF醇大組、GSF醇小組、GSF水大模型準(zhǔn)備同前，取模

5、型組皮下淋巴結(jié)，制備淋巴細胞總液，置于96孔培養(yǎng)板中，同時加入藥物血清，72小時后，用MTT比色法測定細胞增殖的作用。 4選用免疫組化、組織學(xué)觀察方法測量免疫性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-3和TIMP-1含量作為GSF的免疫調(diào)節(jié)作用實驗。實驗試劑使用兔抗大鼠MMP-3單克隆抗體，生物素化山羊抗兔IgG，免疫組化SABC試劑盒，AlcianBlue染料。大鼠隨機分為兩組，測量GSF治療前后大鼠關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-3和TIMP-1

6、含量。切片經(jīng)HE染色、免疫組化染色和AB染色后進行組織學(xué)觀察。通過與計算機相連的顯微攝影系統(tǒng)采集圖像，利用Tiger920軟件進行圖像分析，半定量測定TIMP-1、MMP-3的積分光密度(IOD)和平均光密度(AOD)。治療時間為5周。 5過山楓乙醇提取物安全性實驗共4項，分別是(1)以GSF大鼠體內(nèi)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量驗證GSF對大鼠肝臟功能的影響，(2)以大鼠體內(nèi)尿素氮和肌酐含量驗證GSF對腎功能影響，(3)以大鼠

7、體重以及胸腺、脾臟、肝臟、子宮、卵巢重量變化驗證GSF藥物安全性。 5.1GSF對大鼠體內(nèi)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶影響。使用上海生物利民研究所生產(chǎn)的試劑盒，按說明書操作，給藥三十天后測量大鼠體內(nèi)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量。 5.2GSF對大鼠腎功能影響。大鼠隨機分為五組，經(jīng)口服給藥，采用脲酶-BERttelo方法分別測定各組大鼠血清尿素氮含量，利用在堿性溶液中苦味酸鹽與肌酐作用生成黃紅色苦味酸肝酐復(fù)合物原理測量血清

8、肌苷含量。 5.3GSF對體重、臟器系數(shù)影響。大鼠隨機分為5組、給藥，每周稱體重一次5周后，摘取大鼠胸腺、脾臟、肝臟、子宮和卵巢并稱量重量。 結(jié)果：(1)血清中SOD含量模型組與正常對照組比較無顯著性差異，但醇提小劑量組血清SOD含量顯著高于模型組。 (2)過山楓乙醇提取物可以顯著抑制關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-3、TIMP-1和MMP-3/TIMP-1的表達，從而保護關(guān)節(jié)軟骨，改善類風(fēng)濕的關(guān)節(jié)變化，減少畸形發(fā)生。

9、 (3)醇提大劑量組淋巴細胞增殖作用顯著高于模型組。 (4)GSF有顯著抑制Ⅱ型膠原誘發(fā)的免疫性關(guān)節(jié)炎的炎癥作用，其醇提取物大劑量組作用非常顯著，其延長發(fā)病時間與其它三個藥物組比較差異顯著，提示GSF抗炎作用主要成份在醇提取物成份中。 (5)給藥三十天，GSF對Ⅱ型膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎模型大鼠肝臟功能無明顯毒副作用，模型大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于對照組。 (6)GSF口服給藥，對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠腎

10、臟功能無明顯毒副作用，尿素氮在正常范圍之內(nèi)。 (7)GSF口服給藥，對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠腎臟功能無明顯毒副作用，肌苷在正常范圍之內(nèi)。 (8)實驗前二周，各組體重?zé)o顯著性差異，第三周時雷公滕組和醇提大劑量組體重明顯大于單純模型組，第四周、第五周所有實驗組動物平均體重呈進行性增長，而模型組體重停滯或減輕，與實驗組比較差異顯著。表明GSF對實驗?zāi)Ｐ痛笫篌w重增長無顯著影響，在同一病理模型狀態(tài)下，模型大鼠后期體重減輕，而給

11、藥組體重進行性增長。 (9)GSF給藥五周后，胸腺指數(shù)均高于模型對照組，水提組與模型組比較差異顯著；實驗組肝臟指數(shù)小于模型對照組，與模型組比較醇提大劑量組，水提組肝指數(shù)下降，只有統(tǒng)計學(xué)意義；實驗各組與模型組比較，子宮和卵巢無顯著變化。 結(jié)論：(1)過山楓乙醇提取物具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的藥理作用；(2)過山楓乙醇提取物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有明確的治療作用；(3)過山楓乙醇提取物在治療濃度時，對肝臟、腎臟和子宮等重要臟器沒有明顯的