青風(fēng)藤醇提物治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效及其作用機(jī)制的探究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一類發(fā)病機(jī)制不明確的自身免疫性疾病，其發(fā)病緩慢，滑膜呈腫痛樣增生，形成血管翳，造成軟骨和骨的破壞。RA在中醫(yī)上屬于“痹證”的范疇，在中醫(yī)基礎(chǔ)上治療RA的歷史久遠(yuǎn)，其中青風(fēng)藤是治療的首選藥，它具有祛風(fēng)通絡(luò)引經(jīng)，治療風(fēng)濕痹痛，直達(dá)病所。青藤堿（sinomenine，SIN）是青風(fēng)藤中常被人們研究的主要活性有效成分，青藤堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等作用。近些年來對(duì)青藤堿

2、的研究較多，而青風(fēng)藤95％醇提物對(duì)RA治療效果卻只有很少的研究。
　　目的:
　　本研究以抑制滑膜增生以及骨的破壞為調(diào)節(jié)核心，對(duì)青風(fēng)藤95％醇洗脫物治療RA進(jìn)行體內(nèi)、體外研究，運(yùn)用理論和技術(shù)的更新，了解相關(guān)的機(jī)制，探索青風(fēng)藤醇提物治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的優(yōu)勢(shì)，指導(dǎo)臨床合理用藥。
　　觀察青風(fēng)藤通過大孔樹脂洗脫得到的95％乙醇洗脫物對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠(collagen induced arthritis，CIA)的療效，進(jìn)

3、一步將青風(fēng)藤95％醇洗脫物與青藤堿單體對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效做一個(gè)比較，同時(shí)以FLS和PBMC作為一個(gè)靶點(diǎn)來初步探討可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、有效部位的分離
　　1.1 將青風(fēng)藤的根莖用粉碎機(jī)粉碎，大約用8倍藥量的95％乙醇回流總提取2次，每次沸騰后約2h，再合并兩次的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空蒸發(fā)至稠浸膏狀，加入蒸餾水稀釋，制成青風(fēng)藤的混懸液。
　　1.2 用不同濃度的乙醇通過AB-8大孔樹脂對(duì)青風(fēng)藤

4、混懸液進(jìn)行洗脫，得到不同濃度的乙醇洗脫物。再運(yùn)用HPLC測(cè)定不同濃度的乙醇洗脫物中青藤堿的含量。
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　2.1 使用牛II型膠原誘導(dǎo)的SD大鼠關(guān)節(jié)炎（CIA）模型，造模成功的隨機(jī)分為4組，剩余的為空白對(duì)照組:
　　(1)模型組(MODEL，n=9);
　　(2)青風(fēng)藤醇洗脫物高劑量組(High does QFT，H-QFT，n=9);
　　(3)青風(fēng)藤醇洗脫物低劑量組(Low dose QF

5、T，L-QFT，n=9);
　　(4)青藤堿組(SIN，n=9);
　　(5)空白對(duì)照組(CONTROL，n=10)，
　　2.2 H-QFT組(120mg/kg/d灌胃2ml)、1-QFT組(60mg/kg/d灌胃1ml+生理鹽水1ml)、SIN組(正清風(fēng)痛寧120mg/kg/d灌胃2ml)、模型組（生理鹽水灌胃2ml）、空白對(duì)照組(生理鹽水灌胃2ml)。
　　2.3 采用關(guān)節(jié)評(píng)分法對(duì)大鼠關(guān)節(jié)兩個(gè)記錄員每隔三天

6、進(jìn)行關(guān)節(jié)指數(shù)(AI)評(píng)分，同時(shí)觀察大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀態(tài)。
　　2.4 ELISA試劑盒測(cè)定大鼠血清中IL-17、OPG、RANKL的表達(dá)水平。
　　3、體外實(shí)驗(yàn)
　　3.1 取進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)RA患者的滑膜組織分離培養(yǎng)成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)和從提取健康人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
　　3.2 用Methyl thiazolyl tetraolium法(MTT)檢測(cè)不同藥物對(duì)FLS和PBMC增殖情況

7、增殖的影響。
　　3.3 用RT-PCR的方法檢測(cè)FLS中RANKL中的mRNA表達(dá)水平。
　　3.4用TRAP染色法觀察藥物對(duì)于OC分化的影響
　　3.5 用RT-PCR的方法檢測(cè)不同藥物對(duì)PBMC中OC分化轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、有效部位的分離
　　1.1 方法學(xué)的建立:λ=262nm，柱溫:30℃，流動(dòng)相:水（用磷酸及三乙胺調(diào)整PH至7.8）—乙腈(40∶6

8、0)。
　　1.2 含量的測(cè)定:QFT的95％乙醇洗脫物與SIN的出峰時(shí)間及含量相似。
　　2、體內(nèi)試驗(yàn)
　　造模后大鼠關(guān)節(jié)炎腫脹程度在第21d出現(xiàn)第一個(gè)高峰，在第36d左右會(huì)出現(xiàn)第2個(gè)炎癥高峰。造模成功大鼠36只，按關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評(píng)分為H-QFT組、L-QFT組、SIN組、MODEL組，每組9只。
　　2.1 H-QFT組、L-QFT組以及SIN組大鼠體重均得到不同程度的控制。
　　2.2 H-QFT

9、組、L-QFT組以及SIN組與MODEL組相比能顯著抑制大鼠關(guān)節(jié)腫脹(P＜0.05)。
　　2.3 H-QFT組IL-17水平顯著低于MODEL組(P＜0.05)。
　　2.4 H-QFT組顯著下調(diào)RANKL水平(P＜0.05)，H-QFT組、L-QFT組以及SIN組均能夠上調(diào)OPG水平(P＜0.05)。
　　3、體外實(shí)驗(yàn)
　　3.1取進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者的滑膜組織分離培養(yǎng)FLS，選取培養(yǎng)至3-5代的細(xì)胞用于

10、實(shí)驗(yàn)，此時(shí)的細(xì)胞形態(tài)較好，增值速度快。
　　3.2不同藥物組處理細(xì)胞24h后，其中 H-QFT組的細(xì)胞抑制率與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)。
　　3.3 REAL-TIME PCR檢測(cè)48h不同藥物組對(duì)PBMC細(xì)胞RANKL、OPG表達(dá)的影響，H-QFT組與其它組相比能夠顯著降低RANKL的表達(dá)，上調(diào)OPG表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、有效部位分離:加8倍體積的95％的乙醇提取2h，所得出的青藤堿含量最高。

11、
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):H-QFT組能夠顯著緩解大鼠的關(guān)節(jié)腫脹、降低IL-17的分泌水平，更好的發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)一步有效的抑制炎癥;同時(shí)能夠降低RANKL表達(dá)提高OPG水平，與其他組比有顯著性差異(P＜0.05)。
　　3、體外實(shí)驗(yàn):H-QFT組顯著抑制RA滑膜細(xì)胞的增殖，還能顯著抑制RANKL的中mRNA的表達(dá);NFATc1是破骨細(xì)胞分化的啟動(dòng)因子，對(duì)其基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，加入了藥物后可以抑制RANKL對(duì)NFATc1的基因的