LSD1在口腔鱗狀細胞癌中的生物學作用及其化學抑制抗癌的實驗研究.pdf

1、口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC，簡稱口腔鱗癌）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，局部復發(fā)和頸淋巴結轉移是其致死的主要原因。然而，口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中關鍵的細胞及分子生物學事件，特別是致病癌基因或抑癌基因的功能及機制仍不十分明確，且缺乏抗口腔鱗癌生物/化學治療的精確靶點以提高患者的生存率和生存質量。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(Lysine-specific histone demet

2、hylase1，LSD1)是近年來首先被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶，主要通過去除H3K4m2/1和H3K9m2/1的甲基參與基因的調控過程。目前已有研究證實LSD1在多種惡性腫瘤中呈高表達，且其異常表達常與腫瘤的惡性臨床病理學特征和患者的治療預后相關。更重要的是，LSD1已成為抑制腫瘤的生物治療靶點。研究表明應用小分子化合物和小干擾RNA能抑制癌細胞中的LSD1表達，從而產生抑制腫瘤生長、促使癌細胞凋亡等抗癌作用。然而，迄今為止，LSD1在

3、口腔鱗癌組織中的表達情況及其生物學功能尚未見研究報道。
　　目的：本研究主要致力于探討組蛋白去甲基化酶LSD1在口腔鱗癌中的表達及其生物學功能，揭示靶向LSD1的小分子化學抑制劑對口腔鱗癌的體內外抑制作用。
　　方法：⑴通過定量RT-PCR、Western blotting和細胞免疫熒光檢測口腔鱗癌細胞系中LSD1的表達水平與胞內定位。⑵通過Western blotting和免疫組織化學檢測口腔鱗癌組織標本中LSD1的表達，

4、并統(tǒng)計學分析LSD1的表達水平與患者臨床病理參數(shù)、總體生存率的關系。⑶通過構建DMBA誘導的金黃地鼠頰癌模型，應用免疫組織化學染色檢測在口腔頰黏膜癌變主要階段，標本中LSD1的表達水平。⑷應用siRNA介導的基因沉默策略抑制口腔鱗癌細胞中的LSD1，通過MTT、流式凋亡、遷移、侵襲以及體內成瘤等實驗，檢測相關基因的表達情況，觀察口腔鱗癌細胞中LSD1沉默對細胞惡性表型、腫瘤體內生長的影響。⑸選擇LSD1特異性小分子抑制劑巴吉林(parg

5、yline，PG)和反苯環(huán)丙胺(tranylcypromine，TCP)體外作用于口腔鱗癌細胞，通過Western blotting驗證PG和TCP對細胞中LSD1的抑制作用;再通過MTT、流式凋亡和遷移等實驗，檢測相關基因的表達改變，觀察口腔鱗癌細胞中LSD1沉默對細胞惡性表型的影響。⑹構建裸鼠口腔鱗癌荷瘤模型，待成瘤后分別予以PG或TCP腹腔注射，觀察對移植瘤生長的影響;治療干預后獲取移植瘤標本，檢測標本體積與重量，并通過HE和免疫

6、組化染色觀察不同組織標本中LSD1、Ki67等基因表達的差異。
　　結果：①定量RT-PCR、Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌細胞中LSD1 mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于人永生化細胞HIOEC;細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)LSD1主要位于胞核中，少量位于胞漿中。②臨床新鮮口腔鱗癌標本W(wǎng)estern blotting檢測發(fā)現(xiàn)，癌組織中LSD1蛋白表達水平顯著高于癌旁正常黏膜;免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)LSD1在64例口腔鱗癌

7、標本中有42例呈強陽性表達，弱陽性22例;另外，LSD1的表達水平與腫瘤頸淋巴結(P=0.0329)、臨床分期（P=0.0346）及總體生存率（P=0.0447）有關;多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)LSD1的表達水平是影響患者總體預后的獨立因素之一(P=0.028)。③在DMBA誘導的金黃地鼠頰癌病變進展的不同階段，標本中LSD1的表達水平逐漸增高。④應用siRNA能有效抑制口腔鱗癌細胞中的LSD1表達;LSD1沉默后癌細胞增殖、遷移、侵襲和體外克

8、隆成球能力被抑制，而細胞凋亡被誘導;將LSD1沉默細胞和對照組細胞移植至裸鼠皮下發(fā)現(xiàn)成瘤能力未見明顯差異，而LSD1沉默細胞移植瘤的生長顯著慢于對照組移植瘤。⑤PG和TCP能在體外有效抑制口腔鱗癌細胞中的LSD1表達，并呈劑量和時間依賴效應;PG和TCP體外干預后，抑制細胞增殖和遷移，誘導細胞發(fā)生凋亡。⑥對裸鼠口腔鱗癌異位移植瘤模型進行PG和TCP化學干預后，顯著抑制移植瘤的生長，以及移植瘤中LSD1、Ki67的表達。
　　結論：