低氧對人肺動脈平滑肌細胞線粒體途徑凋亡的影響及葛根素的干預作用.pdf

1、目的： 1.研究低氧對人肺動脈平滑肌細胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells，HPASMCs)線粒體途徑凋亡的影響； 2.研究葛根素對缺氧HPASMCs的干預作用及機制。 方法： 采用CCK-8染色法測定常氧和24小時低氧情況下HPASMCs的活性，及不同濃度葛根素(0.1μM，1μM，10μM，50μM，100μM，1Mm)對低氧HPASMCs活性的

2、抑制，并選擇合適濃度。人肺動脈平滑肌細胞分成3組：正常對照組(21％O2，5％CO2，24h)，24h低氧組(5％O2，5％CO2，24h)，24h低氧+葛根素組(5％O2，5％CO2，24h，葛根素終濃度：1mM)。每次實驗前均用無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓24小時使細胞同步化，實驗重復6次。采用TUNEL法檢測各組HPASMCs凋亡指數(shù)；激光共聚焦顯微鏡羅丹明123(R-123)熒光染色法檢測各組HPASMCs線粒體膜電位(△ψm)；W

3、estern blot法分別檢測各組HPASMCs的胞漿和線粒體內細胞色素C的蛋白含量；分光光度法測定各組HPASMCs的Caspase-9酶活性；免疫細胞化學法測定各組HPASMCs胞漿Bcl-2、Bax的蛋白表達。 結果： 1.與常氧HPASMCs比較，24h低氧情況下HPASMCs CCK-8的吸光度(absorbance，A)值顯著升高(P<0.05)；葛根素濃度為1μM時，低氧HPASMCs的A值開始下降，但未

4、達到統(tǒng)計學意義(P>0.05)；濃度在10μM-1mM之間，A值較單純低氧HPASMCs明顯下降(P<0.05)，并呈量效關系；葛根素濃度為1mM時，對細胞活性的抑制率達21.7％，A值接近于正常值。 2.與正常對照組比較，24h低氧組的HPASMCs的凋亡指數(shù)有所減低，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；24h低氧+葛根素組的HPASMCs的凋亡指數(shù)較24h低氧組明顯升高，接近3.5倍。 3.24h低氧組較正常對照組HPAS

5、MCs的R-123熒光強度明顯增強(P<0.05)；24h低氧+葛根素組較24h低氧組HPASMCs的R-123熒光強度減弱，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 4.24h低氧組較正常對照組HPASMCs的線粒體內細胞色素C蛋白含量增加(P<0.05)，而胞漿內細胞色素C蛋白含量減少(P<0.05)；24h低氧+葛根素組較24h低氧組HPASMCs線粒體內細胞色素C蛋白含量減少(P<0.05)，而胞漿內細胞色素C蛋白含量增加(P<0

6、.05)。 5.與正常對照組比較，24h低氧組HPASMCs內Caspase-9酶活性下降(P<0.05)；24h低氧+葛根素組較24h低氧組HPASMCs內Caspase-9酶活性升高(P<0.05)。 6.與正常對照組比較，24h低氧組HPASMCs胞漿內Bcl-2蛋白表達增加，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Bax蛋白表達兩者無明顯差異(P>0.05)；24h低氧+葛根素組較24h低氧組HPASMCs胞漿內Bcl-

7、2蛋白表達減少(P<0.05)，Bax蛋白含量減少(P<0.05)。 結論： 1.低氧可誘導肺動脈甲滑肌細胞活性增加，凋亡減少。 2.低氧條件下肺動脈平滑肌細胞的線粒體途徑凋亡抑制，可能是低氧性肺動脈高壓肺動脈平滑肌肌層重構的重要機制之一。 3.低氧條件下肺動脈平滑肌細胞胞漿內Bcl-2蛋白和Bax蛋白相對含量變化可能是導致線粒體途徑凋亡減少的重要機制之一。 4.葛根素具有促進低氧性肺動脈半滑肌細