香煙對氣道平滑肌細胞蛋白激酶C的影響及其在哮喘氣道重建發(fā)病機理中的意義.pdf

1、目的：眾所周知，吸煙有害健康。香煙燃燒時產(chǎn)生的煙霧中含有數(shù)千種化學物質(zhì)，其中數(shù)百種是有害有毒物質(zhì)，這些有害有毒物質(zhì)可引起多系統(tǒng)疾病，尤其是呼吸系統(tǒng)疾病，如慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性肺心病、肺癌等。雖然目前尚無實驗證實吸煙可直接引起支氣管哮喘(簡稱哮喘)，但是已有研究證實香煙煙霧(cigarettesmoke，CS)可增加成人及兒童哮喘的發(fā)生頻率及癥狀的嚴重程度。吸煙雖可作為哮喘發(fā)作的誘因是哮喘的惡化因子，但其原因尚不明確。 支氣

2、管哮喘的重要特征是慢性氣道炎癥、持續(xù)性氣道高反應性(airwayhyperresponsiveness，AHR)和氣道重建，三者相互作用，互為因果。氣道重建是氣道炎癥和持續(xù)性氣道高反應性長期存在的結果，可導致不可逆性的氣流阻塞。氣道平滑肌作為氣道壁的重要組成成分，其細胞增殖在哮喘氣道重建中起著重要作用，是不可逆性氣流阻塞、持續(xù)性氣道高反應性的重要病理基礎。因此，探討氣道平滑肌細胞(airwaysmoothmusclecells，ASMC

3、s)增殖的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑以明確哮喘發(fā)病機理、尋找更為有效的治療方法，成為目前國內(nèi)、外哮喘研究的熱點之一。 蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑中的一種關鍵酶，是細胞外信號與細胞核反應間信號轉(zhuǎn)導的共同通路，可參與多種細胞的增殖，在多種促有絲分裂因子誘導培養(yǎng)的非哮喘ASMCs的增殖中起重要作用；PKC有多種亞型，且每種亞型的結構和功能各不相同。此外，我們既往的研究表明PKC在哮喘模型大鼠及哮喘患

4、者血清被動致敏人氣道平滑肌細胞(HASMCs)增殖調(diào)控中亦起重要作用。但其詳細機理尚需進一步研究。 香煙煙霧能使卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)致敏的豚鼠氣道炎癥及持續(xù)性氣道高反應性增加。國內(nèi)研究表明香煙煙霧提取物(cigarettesmokeextract，CSE)可使家兔的ASMCs增殖活性增加。研究資料表明CSE可使多種細胞PKC活化。因而推測CSE可能通過激活PKC而在ASMCs的增值、轉(zhuǎn)化、分泌等活動中起作用。

5、 目前國內(nèi)、外通常是分別研究與哮喘有關的各種影響因子對非哮喘ASMCs增殖的影響，但由于非哮喘ASMCs和哮喘ASMCs的表型和功能狀態(tài)存在差異，這種在體外分別以單一因子誘導非哮喘ASMCs增殖來推斷哮喘ASMCs體內(nèi)的增殖特性及信號轉(zhuǎn)導途徑的方法尚存在一定局限性。故以來自哮喘個體的ASMCs為研究對象可能更準確地反映體內(nèi)ASMCs增殖的信號轉(zhuǎn)導途徑。同時，由于哮喘患者的氣道平滑肌細胞很難獲得，國外研究者用變應性哮喘患者血清孵育人

6、ASMCs，為研究哮喘發(fā)病機理提供了一個很好的被動致敏哮喘模型。 銀杏葉(Ginkgo)制劑具有改善血液流變學、清除自由基、拮抗血小板活化因子(PAF)等作用，臨床上主要用于治療老年癡呆、心腦血管疾病、支氣管哮喘和臟器移植的異體排斥等。 因此，本研究擬分動物實驗(第一部分)和人體細胞實驗(第二部分)兩大部分，第一部分又分3個分題，第二部分又分2個分題，評價CSE對哮喘模型大鼠及被動致敏人ASMCs的PKC活性、亞型PKC

7、-α、ζ表達及增殖特性的影響，評價香煙煙霧及銀杏葉(Ginkgo)注射液對哮喘氣道重建的影響，探討CSE是否通過PKC途徑參與了ASMCs的增殖和哮喘氣道重建及銀杏葉對哮喘氣道重建是否具有抑制作用，為進一步明確哮喘發(fā)病機制、尋找更有針對性的治療方法提供一些理論依據(jù)。 方法：本研究通過建立大鼠哮喘模型和大鼠哮喘煙熏模型，培養(yǎng)哮喘大鼠ASMCs；通過哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細胞(HASMCs)，并應用CSE及PKC的激動劑P

8、MA和特異性抑制劑Ro-31-8220等作為工具藥干預上述細胞，采用同位素γ-32P-ATP催化活性測定法檢測PKC的活性；用流式細胞術分析細胞周期、MTT法及氚標－胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)摻入法檢測上述細胞增殖活性；用RT-PCR技術檢測細胞PKC-α及PKC-ζ的mRNA表達；用Westernblot檢測細胞PKC-α及PKC-ζ的蛋白表達。評估CSE對哮喘模型大鼠及被動致敏人ASMCs的PKC活性、增殖特性及PKC亞型PK

9、C-α、ζ表達的影響，探討CSE是否通過PKC途徑參與了ASMCs的增殖及哮喘氣道重建，以更準確地反映CSE影響哮喘ASMCs增殖的調(diào)控機制。 另外，大鼠哮喘氣道重建模型制備后，采用圖像分析系統(tǒng)觀察氣道壁厚度和面積及天狼星紅苦味酸染色觀察氣道壁膠原纖維沉積，采用RT-PCR和Westernblot法檢測氣道組織TGF-β1mRNA和蛋白質(zhì)表達的變化，探討CSE對哮喘大鼠氣道重建的影響。 結果：1.哮喘組大鼠ASMCs的P

10、KC活性、增殖及PKC亞型PKC-α、ζmRNA和蛋白表達均顯著高于對照組ASMCs(P＜0.01)。與對照組比較，5％CSE及50nmol/LPMA均能促進哮喘組大鼠ASMCs的PKC活性、增殖及PKC亞型PKC-α、ζmRNA和蛋白表達的增加，其中以CSE+PMA組更為顯著(P＜0.01)。哮喘組大鼠ASMCs和對照組大鼠ASMCs經(jīng)5μmol/LRo-31-8220預處理后可消除5％CSE及50nmol/LPMA的作用；用5μmo

11、l/LRo-31-8220能抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖及PKC亞型PKC-α、ζ的表達(P＜0.01)。2.哮喘煙熏組大鼠氣道ASMCs增殖、氣道壁厚度和面積及膠原面積顯著高于哮喘組(P＜0.01)；哮喘組大鼠氣道ASMCs增殖、氣道壁厚度和面積及膠原面積又顯著高于對照組(P＜0.01)。哮喘模型制備成功后，每天每次OVA激發(fā)后，再給予香煙煙霧吸入，連續(xù)8周，成功制備哮喘吸煙模型。3.哮喘血清被動致敏的HASMCs的PKC活性、增殖及

12、PKC亞型PKC-α、ζmRNA和蛋白表達均顯著高于對照血清處理的HASMCs(P＜0.01)。與對照組比較，5％CSE及50nmol/LPMA均能促進被動致敏的HASMCs的PKC活性、增殖及PKC亞型PKC-αmRNA和蛋白表達和PKC亞型PKC-ζ蛋白表達的增加，其中以CSE+PMA組更為顯著(P＜0.01)。5μmol/LRo-31-8220能顯著抑制被動致敏的HASMCs增殖及PKC亞型PKC-αmRNA和蛋白的表達(P＜0.

13、05)。4.銀杏葉注射液可以明顯減弱哮喘煙熏組及哮喘組大鼠增加的氣道壁厚度和面積、膠原面積及氣道組織TGF-β1mRNA和蛋白質(zhì)表達的程度。 結論：1.CSE使哮喘模型大鼠及被動致敏人ASMCs的PKC活性、增殖及PKC亞型PKC-α、ζmRNA和蛋白表達增加。2.CSE使哮喘模型大鼠及被動致敏人ASMCs的增殖及PKC亞型PKC-αmRNA和蛋白表達增加、PKC亞型PKCζ蛋白表達增加。3.CSE可能通過PKC途徑增加哮喘大鼠

14、和被動致敏人的ASMCs增殖。4.首次成功建立大鼠哮喘煙熏氣道重建模型。5.CSE可能參與了哮喘模型大鼠的氣道重建過程；CSE使氣道組織TGF-β1mRNA和蛋白質(zhì)表達增加。6.銀杏葉可能通過部分減弱哮喘煙熏組及哮喘組大鼠增加的氣道壁厚度和面積、膠原面積及氣道組織TGF-β1mRNA和蛋白質(zhì)表達的增加，從而對模型大鼠的氣道重建具有抑制作用。 綜上所述，本課題通過動物實驗和人體細胞實驗，結果表明CSE可能通過PKC途徑參與了哮喘大