酵母構(gòu)象型隨機(jī)肽庫的構(gòu)建及BAFF-R-TRAF3復(fù)合物解離肽的篩選.pdf

1、BAFF，又稱BLyS，TALL-1，THANK，zTNF4或TNFSF-13B，是1999年發(fā)現(xiàn)的TNF家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，BAFF能促進(jìn)B細(xì)胞的存活和成熟，在體液免疫中發(fā)揮重要作用，BAFF過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病。BAFF有三個(gè)受體，分別為BCMA、TACI、BAFF-R／BR3。其中BAFF-R被認(rèn)為是最主要的受體。BAFF-R介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的替代NF-~B途徑，BAFF三聚體誘導(dǎo)BAFF-R在膜上聚集，通過募集TRAF3接頭分子

2、，激活NF．KB。以BAFF-R／TRAF3復(fù)合物為研究對象，篩選促BAFF-R／TRAF3解離的小肽，阻斷BAFF-R介導(dǎo)的信號(hào)通路，可以為自身免疫性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。研究工作的結(jié)果可概括為以下幾個(gè)方面： (1)通過RT-PCR方法釣取BAFF-R胞內(nèi)區(qū)和TRAF3C端258-568aa的cDNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBD-BAFF-R和pAD-TRAF3-C，利用酵母雙雜交驗(yàn)證了兩者的相互作用。構(gòu)建pM-BAFF-R和p

3、VPl6-TRAF-C表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，利用哺乳動(dòng)物雙雜交進(jìn)一步驗(yàn)證了兩者的相互作用。構(gòu)建了一系列的TRAF3缺失突變體，利用酵母雙雜交確定TRAF3的328~400aa，428~463aa．543-560aa參與了與BAFF-R的結(jié)合。 (2)以硫氧還蛋白(Trx)為骨架，在橋質(zhì)粒pBD-BAFF-R條件型啟動(dòng)子PMET25的下游構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)的酵母構(gòu)象型隨機(jī)lO肽庫。利用PCR擴(kuò)增出trx基因，通過重疊延伸PC

4、R向trx的突環(huán)區(qū)引入AscI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pBD-BAFF-R-mTrx重組載體。采用(NNK)10的編碼方式設(shè)計(jì)并合成兩條寡核苷酸鏈，經(jīng)退火、延伸，AscI／RsrⅡ雙酶切，克隆至pBD-BAFF-R-mTrx載體，電轉(zhuǎn)化E．coliDHlOB感受態(tài)細(xì)胞。最終獲得庫容量為8.7×1O8的酵母構(gòu)象型隨機(jī)肽庫；隨機(jī)挑選20個(gè)克隆進(jìn)行測序，4個(gè)核苷酸的出現(xiàn)頻率與理論值接近；免疫印跡結(jié)果表明，在Met缺陷培養(yǎng)基中，隨機(jī)肽庫可被誘導(dǎo)表達(dá)，表明

5、構(gòu)建的肽庫是成功的。 (3)解離肽的篩選及初步的功能研究，將構(gòu)建好的pBD-BAFF-R文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y190(pAD．TRAF3-C)，挑選在三缺SD／-Trp／-Leu／-His培養(yǎng)基上生長良好，變藍(lán)的菌落，接種在四缺SD／-Met／-Trp／-Leu／-His培養(yǎng)基上，選擇不生長、不變藍(lán)的菌落即為預(yù)期的陽性克隆。最終得到6個(gè)候選解離肽的陽性克隆。選取2條小肽(P1、P2)進(jìn)行人工合成。初步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，Pl能特異

6、性地抑制BAFF刺激外周血B淋巴細(xì)胞增生的活性。 (4)利用酵母三雜交系統(tǒng)，以BAFF-R胞內(nèi)區(qū)／TRAF3復(fù)合物為誘餌，篩選人脾cDNA文庫，獲得新的TRAF3相互作用蛋白R(shí)IPK2，并利用哺乳動(dòng)物雙雜交進(jìn)一步驗(yàn)證了兩者的相互作用。 本研究以BAFF-R／TRAF3復(fù)合物為例，探討了利用構(gòu)建的酵母構(gòu)象型隨機(jī)肽庫篩選促蛋白復(fù)合物解離的方法，獲得的解離肽可阻斷蛋白組份所介導(dǎo)的信號(hào)通路，對于治療由于信號(hào)通路異常激活而導(dǎo)致的疾