siRNA雙靶向干擾IL-1β-TNF-α治療肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肩袖疾病(rotatorcuffdisease，RCD)是引起肩周疼痛、肩關(guān)節(jié)功能障礙的最常見原因。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，我們對(duì)于肩袖疾病形成機(jī)理及有了更深入的認(rèn)識(shí)。逐漸認(rèn)識(shí)到：肩峰下滑囊炎(subacromialbursitis)是導(dǎo)致肩袖疾病患者肩痛及功能障礙的重要原因。肩峰下滑囊細(xì)胞是肩峰下滑囊炎的核心細(xì)胞，非特異性刺激(機(jī)械牽拉、缺氧、炎性細(xì)胞及臨近肩袖腱細(xì)胞)可通過囊壁上的壓力或化學(xué)感受器刺激其分泌IL－1、TNF

2、-α，MMP－1、MMP-9、COX－1、COX-2、SDF－1、P物質(zhì)及VEGF多種炎性因子形成了一個(gè)調(diào)控慢性炎癥反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，而IL－1β及TNF-α是這個(gè)炎性網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子。遺憾的是，盡管大理的研究都證實(shí)了這些細(xì)胞因子對(duì)肩峰下滑囊炎的起病與發(fā)展起到了十分重要的作用，但大都僅局限在機(jī)制的探討上，尚未有應(yīng)用這些因子治療肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的相關(guān)報(bào)道。
　　 小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是

3、含有21～23bp的雙鏈RNA，可以序列特異性地切割靶RNA，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，抑制蛋白質(zhì)的合成，而不誘導(dǎo)非特異性的雙鏈RNA反應(yīng)。近年來，RNAi作為一種高效的序列特異性基因剔除技術(shù)在基因治療領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。到目前為止，國內(nèi)外尚未有應(yīng)用RNAi技術(shù)肩袖疾病的相關(guān)報(bào)道。木實(shí)驗(yàn)中，我們利用siRNA雙靶向干擾肩峰下滑囊細(xì)胞的IL－1β及TNF－α僅基因，評(píng)價(jià)IL－1β及TNF-α基因剔降效果及對(duì)這個(gè)炎性網(wǎng)絡(luò)中其它炎性因子的影響。

4、>　　 目的：
　　 旨在明確肩峰下滑囊細(xì)胞類型及病理特征；探討利用RNAi手段沉默人肩峰下滑囊細(xì)胞IL－1β及TNF－α基因的可行性；評(píng)價(jià)IL－1β及TNF－α基因剔降效果及對(duì)這個(gè)炎性網(wǎng)絡(luò)中其它炎性因子的影響；進(jìn)一步揭示肩袖疾病肩峰下滑囊炎發(fā)病機(jī)制及IL－1β及TNF-α在其炎性環(huán)路中的作用；為肩袖疾病臨床治療、未來基因治療及藥物篩選提供重要理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.取肩袖疾病患者肩峰下滑囊標(biāo)本，通

5、過平面培養(yǎng)的方法，采用改良雙酶消化法分離、體外培養(yǎng)、純化肩峰下滑囊細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，通過H－E染色、Vimentin及CD68免疫熒光染色鑒定明確細(xì)胞類型。
　　 2.設(shè)計(jì)合成針對(duì)人IL－1β基因序列特征設(shè)計(jì)特異siRNA－(1－3)，及針對(duì)人TNF-α基因序列特征設(shè)計(jì)特異siRNA－(a-c)，以陽離子脂質(zhì)體為載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的肩峰下滑囊細(xì)胞；FAM熒光標(biāo)記，測定轉(zhuǎn)染率，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)。Westenblot篩選出針對(duì)I

6、L-1β及TNF-α基因的有效siRNA序列，進(jìn)一步通過Realtime-PCR檢測siRNA抑制肩峰下滑囊細(xì)胞IL-1β及TNF-α基因表達(dá)效果及劑量、時(shí)間相關(guān)性。
　　 3.利用篩選出的針對(duì)IL－1β及TNF-α基因的有效siRNA序列，雙靶向干擾肩峰下滑囊細(xì)胞，Realtime-PCR檢測IL－1β、TNF-α、MMP-1、MMP-9、COX－1、COX-2及SDF－1等細(xì)胞因子表達(dá)水平，以不加siRNA的滑囊細(xì)胞做空白對(duì)

7、照，評(píng)價(jià)IL－1β及TNF-α基因剔降后對(duì)這個(gè)炎性網(wǎng)絡(luò)中其它炎性因子的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.人肩峰下滑囊原代細(xì)胞貼壁良好。傳至第3代后以長梭形細(xì)胞均勻生長。HE染色，普通光鏡下，細(xì)胞呈梭型，核呈圓形，較大，核仁明顯，免疫熒光結(jié)果顯示Vimentin陽性，CD68陰性，符合成纖維樣滑膜細(xì)胞特征。
　　 2.FAM熒光標(biāo)記后測定轉(zhuǎn)染率都在80％以上，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)及生長均無明顯影響；Westenblot

8、結(jié)果顯示IL－1β-siRNA－2及TNF－α-siRNA－c相對(duì)基因抑制水平最強(qiáng)；Realtime－PCR檢測顯示siRNA抑制肩峰下滑囊成纖維樣滑膜細(xì)胞IL－1β及TNF-α基因表達(dá)時(shí)存在相似的劑量、時(shí)間相關(guān)性，隨siRNA終濃度增加，抑制效率增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染后24h抑制最強(qiáng)，48h后逐漸減弱。
　　 3.siRNA－2、siRNA－c均以終濃度200nmol/L同時(shí)轉(zhuǎn)染肩峰下滑囊成纖維樣滑膜細(xì)胞，以不加siRNA的滑囊細(xì)胞做空白

9、對(duì)照，Realtime-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后IL－1β及TNF-α的表達(dá)被明顯抑制。MMP－1、MMP－9、COX－1的抑制效果同對(duì)照組相比有顯著差異，COX-2、SDF－1的抑制效雖不顯著，但仍有抑制。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用改良雙酶消化法可成功擴(kuò)增并獲得相當(dāng)數(shù)量的肩峰下滑囊細(xì)胞。
　　 2.經(jīng)鑒定，肩峰下滑囊細(xì)胞培養(yǎng)至第3代為純度較高的成纖維樣滑膜細(xì)胞。
　　 3.化學(xué)合成的IL－1β、TNF

10、-α特異siRNA通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以有效抑制肩峰下滑囊成纖維樣滑膜細(xì)胞IL－1β、TNF-α基因的表達(dá)。
　　 4.siRNA抑制肩峰下滑囊成纖維樣滑膜細(xì)胞IL－1β及TNF－α基因均存在良好的劑量、時(shí)間相關(guān)性。
　　 5.利用siRNA雙靶向干擾技術(shù)可成功剔降IL－1β、TNF-α基因的表達(dá)，并同時(shí)下調(diào)了炎性網(wǎng)絡(luò)中炎性因子MMP－1、MMP－9、COX－1、COX-2及SDF－1的表達(dá)。對(duì)炎性網(wǎng)絡(luò)有明確的抑制作用。