阻斷IL-1與TNF-α治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的初步探索.pdf

1、該研究旨在通過對IL-1ra突變體和TNFRⅡ<,15-157>與IgG鉸鏈區(qū)融合蛋白的研究,進(jìn)行阻斷IL-1與TNF-α治療RA的初步探索.第一,篩選更加有效地阻斷IL-1的IL-1ra突變體.首先構(gòu)建了IL-1ra的突變體庫,通過噬菌體表面呈現(xiàn),利用膜上富含IL-1R的EL-4細(xì)胞對噬菌體-IL-1ra突變體進(jìn)行親和富集和phage-ELISA篩選,共篩選到21個(gè)與EL-4和Raji細(xì)胞都特異性結(jié)合的克隆,經(jīng)過序列分析確定其中有11

2、個(gè)是發(fā)生了錯(cuò)義突變的IL-1ra.為了進(jìn)一步檢測所獲得的突變體的活性,將野生型IL-1ra與獲得的突變體cDNA分別插入表達(dá)載體pTIG-Trx,在大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá).現(xiàn)在已經(jīng)成功表達(dá)了野生型IL-1ra和10個(gè)突變體,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過鎳金屬螯合層析和凝膠過濾兩步純化后獲得了純度在97﹪以上的目的蛋白.利用EL-4、CTLL-2細(xì)胞對目的蛋白進(jìn)行體外活性檢測的結(jié)果證明,獲得突變體中有三個(gè)活性得到提高,其中40-22號F50L

3、的活性提高大約有7-8倍,40-4號D95G和50-4號T76A活性大約提高5倍.第二,為了獲得阻斷TNF-α的生物分子,我們構(gòu)建了sTNFRⅡ與TNF結(jié)合域(TNFRⅡ<,15-157>)與IgG鉸鏈區(qū)的融合序列并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá).首先從U937細(xì)胞提取總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增TNFRⅡ<,15-157> cDNA,然后通過重疊延伸PCR使TNFRⅡ<,15-157>與人工合成的IgG鉸鏈區(qū)序列融合.融合cDNA片段插入表

4、達(dá)載體pTIG-Trx,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后獲得了可溶性的表達(dá)產(chǎn)物,目的蛋白經(jīng)過鎳金屬螯合層析和凝膠過濾層析后純度達(dá)到95﹪以上.體外細(xì)胞活性檢測表明融合蛋白F:RⅡ<,15-157>-FcH能夠阻斷TNF與受體的結(jié)合,減輕TNF的細(xì)胞毒性.sTNFRⅡ在大腸桿菌中有活性的表達(dá)在國內(nèi)外尚未見報(bào)道.第三,建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(Collagen Induced Arthritis,CIA),對獲得的蛋白進(jìn)行體內(nèi)活性評價(jià).以上