自體骨髓源性肝干細胞體外擴增后移植治療肝炎后肝硬化的臨床研究.pdf

1、目前肝移植是治療末期肝病的一種有效的治療方法,但由于供體缺乏、免疫排斥和高額費用等一系列的問題,以至于肝移植的臨床運用受到限制,難以滿足眾多的肝病患者治療的需求。眾多的肝病學家們也一直在探索一種可以補充的甚至于能夠代替肝移植來治療肝臟疾病的方法。隨著細胞學等相關學科的發(fā)展,使得應用肝干細胞來治療肝臟疾病成為可能。肝干細胞可以分化為與其自身的基因一致的肝細胞及膽管細胞,作為肝干細胞的一種,骨髓源性肝干細胞(Bone marrow deri

2、ved liver stem cells,BMDLSC)的發(fā)現(xiàn),為肝臟疾病治療提供了新的思路和手段。利用骨髓源性肝干細胞移植的方法來修復因疾病而損傷肝臟,這是一種全新的肝病治療方法,該技術可以修補因等各種因為損傷而減少的肝細胞數(shù)量,可以重建因為肝損傷而遭到破壞的肝臟的組織結構。
　　 近年來,國內外已有眾多專家在研究如何利用肝干細胞來治療肝硬化等終末期肝病的課題。取得了一定的成果,但也存在許多尚待解決的問題。在現(xiàn)有的文獻資料中,

3、絕大多數(shù)學者所采用的技術路線是:直接將抽取的骨髓進行肝動脈或門靜脈輸注移植,或者將骨髓進行簡單的離心分離后再經肝動脈或門靜脈輸注移植。這種直接利用骨髓源性肝干細胞進行移植的技術路線,雖然在方法上相對簡單易行,但最終效果都不夠理想,因為是BMDLSC在骨髓細胞中的含量非常稀少,即使移植較大量的骨髓,BMDLSC的移植數(shù)量也往往不足。我們采用的技術路線是骨髓源性肝干細胞經體外培養(yǎng)擴增后再行肝內移植。這種技術路線在我們的前期動物實驗已經證實是

4、安全有效的,可以增加可供移植細胞中BMDLSC的數(shù)量,可以減少BMDLSC移植的骨髓需要量,從而提高BMDLSC移植的肝病治療效果。
　　 自2004年開始探索利用骨髓源性肝干細胞修復肝臟疾病損傷的研究,建立了骨髓源性肝干細胞在體外培養(yǎng)、擴增的有效技術,可以有效的增加骨髓源性肝干細胞的移植數(shù)量,使移植細胞的數(shù)量和移植細胞定居在肝臟并發(fā)揮治療作用的數(shù)量都得到增加。本研究主要觀察臨床應用自體骨髓源性肝干細胞體外擴增后肝內移植治療肝炎

5、后肝硬化的安全性與有效性。
　　 目的
　　 探索臨床自體骨髓源性肝干細胞在體外培養(yǎng)與擴增后肝內移植治療肝炎后肝硬化的安全性及其效果。
　　 材料和方法
　　 1.病例選擇:2008年1月至2009年4月入住南方醫(yī)院肝膽外科治療的肝炎后肝硬化患者中,符合入選條件的病人12例,其中女性3人、男性9人,平均年齡48.8歲(39-60歲)。病人按入院先后的半隨機方法分為治療組6例和對照組6例。所有的病人都有明確

6、的乙肝病史,肝功能檢查輕度至中度異常,Child-Pugh肝功能評分A～C級,組織病理學檢查顯示肝內廣泛的纖維組織增生,肝小葉結構被破壞,假小葉及再生結節(jié)形成,符合臨床肝炎后肝硬化的診斷標準。
　　 2.自體骨髓源性肝干細胞的采集、體外培養(yǎng)與擴增:治療組患者在接受脾切除、門奇靜脈斷流術治療前一周,在嚴格無菌操作條件下以髂后上棘為穿刺點行骨髓穿刺術抽取骨髓30-40mL,并用肝素鹽水抗凝后,送專門的實驗室進行骨髓源性肝干細胞的分離

7、、體外培養(yǎng)、擴增；在無菌的細胞培養(yǎng)室中利用密度梯度離心法分離出富含CD117陽性細胞和CD184陽性細胞的骨髓單個核細胞群,然后將細胞在體外培養(yǎng)擴增7天,擴增方案采用含10％自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中加促肝細胞生長素(HGPF)、促血小板生長素(TPO)和白細胞介素3(IL-3),此方案在嚴格無菌的層流細胞培養(yǎng)室中完成；將細胞制成細胞懸液,供臨床移植使用,在前期的實驗中用流式細胞計數(shù)法測定擴增細胞中CD117陽性細胞和CD184

8、陽性細胞的數(shù)量變化。
　　 3.體外擴增的自體骨髓源性肝干細胞的肝內移植:在患者接受門奇靜脈斷流術中縫合關閉腹腔前,治療組中,以1mL注射器針頭穿刺肝固有動脈,經肝動脈緩慢注入經體外培養(yǎng)與擴增處理的自體骨髓源性肝干細胞懸液(體積10毫升,細胞平均濃度0.5×107/m1),對照組經肝動脈緩慢注入等體積的生理鹽水。術前術后兩組病人予以相同方案的預防感染、保護肝臟與對癥支持等治療。
　　 4.觀察指標與方法
　　 4

9、.1癥狀與體征:內容包括精神、食欲、體力、黃疽、腹水、下肢水腫、肝性腦病等。
　　 4.2、影像學檢查:術前及術后3個月行肝臟CT及B超檢查,依據(jù)CT所示肝臟體積和肝臟密度(CT值)來評定肝硬化的程度及其變化。
　　 4.3、實驗室檢查:術前及術后3個月分別檢查(1)肝功能:丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、血清白蛋白、血清總膽紅素；(2)凝血功能:凝血酶原時間；(3)肝纖維化指標:透明質酸(HA

10、)、人Ⅲ型前膠原(HPCⅢ),此外我們還記錄了患者在移植術后的2周及1個月的上述的實驗室檢查結果,但此數(shù)據(jù)受影響的因素較多,只能作為臨床參考所用。
　　 5.統(tǒng)計學分析
　　 數(shù)據(jù)以X±SD表示,采用SPSS13.0軟件進行分析,檢驗水準:α=0.05。對一般情況的性別、術前的人Ⅲ型膠原蛋白術前術后人Ⅲ型膠原蛋白變化值因不服從正態(tài)分布而采用非參數(shù)的秩和檢驗、性別構成采用x2檢驗,術前術后的AST、ALT、TBIL、ALB

11、、PT、透明質酸、術后的人Ⅲ型膠原蛋白及其余各項指標的前后的差值均服從正態(tài)分布而采用獨立樣本的t檢驗及配對t檢驗。
　　 結果
　　 1、患者術后3月均自覺癥狀較術前明顯好轉,水腫、黃疸、腹水的體征亦較術前有不同程度的緩解。
　　 2、兩組病人術前的各項檢驗均無統(tǒng)計學差異,兩組病人的術后均未發(fā)現(xiàn)手術并發(fā)癥,治療組6例病人均未發(fā)生過敏反應、排斥反應和其它不良反應。
　　 3、肝功能指標谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶

12、、總膽紅素、血漿白蛋白、凝血酶原時間:治療組由(39±15)U/L、(64±21)U/L、(42.5±13.2)umol/L、(29.8±5.1)g/L、(15.1±1.7)s變?yōu)?24±10)U/L、(38±16)U/L、(23.5±5.5)umol/L、(34.2±5.0)g/L、(13.7±1.1)s；對照組由(38±8)U/L、(55±21)U/L、(31.0±9.9)umol/L、(30.0±2.6)g/L、(15.0±1.2

13、)s變?yōu)?40±13)U/L、(63±21)U/L、(29.1±9.5)umol/L、(28.2±2.7)g/L、(15.9±2.1)s,治療組優(yōu)于對照組(P<0.05);
　　 4、肝纖維化指標:透明質酸、人Ⅲ型前膠原:治療組由(336.2±55.4)ng/mL、(218.8±109.4)ng/mL變?yōu)?290.5±54.3)ng/mL、(186.4±88.5)ng/mL、對照組由(340.5±73.7)ng/mL、(148.

14、1±15.6)ng/mL變?yōu)?342.9±67.9)ng/mL、(153.2±21.0)ng/mL治療組優(yōu)于對照組(P<0.05)。
　　 5、術前及術后3個月患者的CT及B超檢查并無明顯的變化。
　　 結論
　　 1.自體骨髓源性肝干細胞體外擴增后肝內移植是安全的,本研究中12例病人均未出現(xiàn)并發(fā)癥與副作用,自體骨髓源性肝干細胞的體外培養(yǎng)與擴增處理沒有改變干細胞的抗原特性。
　　 2.自體骨髓肝干細胞體外