自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植促進肝硬化肝臟門靜脈栓塞后剩余肝臟再生的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　手術(shù)切除仍然是目前治療肝癌的主要措施;然而由于術(shù)前肝功儲備不足以支持術(shù)后肝功的恢復,80％的患者失去了手術(shù)的機會。研究顯示肝硬化或其他肝損傷存在的情況下,至少要保證40%的剩余肝臟體積才能減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。門靜脈栓塞術(shù)(Portalveinembolization,PVE))是一種擴大剩余肝臟體積的重要措施,但由于合并肝硬化存在時門靜脈栓塞后剩余肝再生能力明顯受限,且明顯延長了術(shù)前等待時間;肝硬化肝臟PV

2、E后剩余肝臟體積擴大的范圍僅在9.6%-14%左右。同時研究顯示經(jīng)歷了術(shù)前PVE治療的患者中,3-30%的患者也往往因剩余肝臟再生不足,或較長時間等待后因腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移失去了手術(shù)機會。在我國80%的肝癌患者合并有不同程度的肝硬化;更需迫切需要一種提高剩余肝體積的方法。
　　近年來干細胞移植逐漸成為一種新的包括肝癌在內(nèi)的肝病治療手段,為提高剩余肝體積提供了一種重要治療工具;特別是間充質(zhì)干細胞(MesenchymalStemCell

3、s,MSCs)移植的應(yīng)用逐漸受到更多的重視。研究顯示MSCs是所有骨髓干細胞亞群中修復肝臟損傷能力最強的干細胞,在體外可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、胰島樣細胞、肝細胞等;具有較明確的改善肝硬化、促進肝功能恢復的作用。骨髓間充質(zhì)干細胞正逐漸成為具有應(yīng)用前景的再生藥物,并有可能成為細胞移植治療肝病的首要選擇。因此,骨髓間充質(zhì)干細胞(BoneMesenchymalStemCells,BMSCs)移植可能為促進促進肝硬化肝臟門靜脈栓塞后剩

4、余肝臟再生提供了一種重要方法。
　　TGF-β是促進肝硬化并抑制肝再生的重要因子,在肝硬化肝臟中存在較高表達。同時在大量實驗研究中顯示封閉TGF-β可明顯抑制纖維化;目前TGF-β1中和抗體已經(jīng)在包括肝纖維化在內(nèi)的各種疾病治療得到了廣泛應(yīng)用。研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin與TGF-β/Smad信號通路通過β-catenin存在交叉,下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路促進了MSCs向肝細胞的分化。因此推測封閉TGF-β1信號

5、能夠促進MSCs向肝細胞,從而進一步增強自體BMSCs移植促進PVE后剩余肝臟再生的效果。
　　綜上所述,本課題在通過四氯化碳腹腔注射建立的大鼠肝硬化模型中,對自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植能否促進肝硬化肝臟門靜脈栓塞后剩余肝臟再生進行了研究,同時研究了其可能的潛在機制。另外對TGF-β1抗體能否對進一步提高自體骨髓MSCs移植促進肝硬化肝臟PVE后剩余肝臟再生進行了初步探討。
　　主要材料方法：
　　自體骨髓MSCs移植促

6、進肝硬化肝臟PVE后剩余肝臟再生的研究;
　　1、CCl4誘導肝硬化模型:根據(jù)文獻報道采用腹腔注射CCl4方法,給予200-250g大鼠SD大鼠飲水中按照0.4g/L比例加入苯巴比妥誘導4天,而后腹腔內(nèi)注射用橄欖油1:1稀釋過的CCl4(3mL/kg,2次/w)8周;飲水中加入15%(V/V)的酒精。
　　2、自體骨髓BMSCs的分離及鑒定:無菌條件下抽取大鼠下肢骨髓后采用梯度離心及貼壁粘附法相結(jié)合分離BMSCs;以CD29

7、+、CD90+、CD45-、IGg同型對照為抗原標志,利用流式細胞儀鑒定BMSCs。同時研究其在體外的多向分化潛能;來驗證所分離的細胞就是骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　3、PKH26-GL標記:所分離的BMSCs用PKH26染色標記,用于視蹤干細胞在體內(nèi)的分布。
　　4、肝硬化肝臟PVE模型(根據(jù)文獻報道進行):肝硬化模型建立后乙醚吸入麻醉下,上腹部正中開腹暴露肝臟及其門靜脈,解剖顯微鏡下分離、結(jié)扎左中葉(占總肝體積70%)門靜脈

8、,用注射器向左、中門靜脈中灌注用碘化油1ml(泛影葡胺稀釋1:1)。
　　5、肝細胞移植:在建立PVE后向門靜脈主干注射分離的2×106自體BMSCs。實驗組注射DMEM培養(yǎng)液,假手術(shù)組建立肝硬化后僅僅行開關(guān)腹,不予行PVE及細胞移植。
　　6、肝再生指標測定:剩余肝臟占總重量百分比、Ki-67標記指數(shù)、肝功。A:剩余肝臟占總重量百分比:右肝+尾葉/總肝重量。
　　B.Ki-67標記指數(shù):采用免疫組化法,ki-67陽性

9、細胞百分百。
　　C.肝功測定:適時處死動物后抽取下腔靜脈血液做肝功分析(自動生化儀),檢測血清ALT、AST、ALB、TBIL水平。
　　7、增生機制的研究指標:
　　A:剩余肝臟內(nèi)的膠原沉積堅持,羥脯氨酸測定、馬松染色、HE染色。
　　B:RT-PCR測定剩余肝臟的HGF、VEGF、MMP-9及IL-10基因表達。
　　C:利用共聚焦技術(shù)檢測BMSCs在肝組織內(nèi)肝細胞的分化,檢測AFP、CK18、ALB

10、的表達。
　　8、在肝細胞分化液(HGF(10ng/Ml)+FGF-4(10ng/Ml)中加入不同濃度的TGF-β(0ng/ml,5ng/mland10ng/mlrespectively)。培養(yǎng)7天后通過RT-PCR檢測AFP基因的表達,培養(yǎng)14天、28天同樣方法分別測定CK18、ALB的表達;用于研究TGF-β對BMSCs向肝細胞分化的影響。
　　9、用DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)擴增BMSCs過程中,加入TGF-β,通過Am-

11、Blue試劑盒研究TGF-β對BMSCs增殖的影響。
　　10、TGF-β1單克隆抗體((Chemicon,Hampshire,UnitedKingdom)作為拮抗劑:PVE建立后由尾靜脈靜脈管注射1mlPBS+20ugTGF-β1單克隆抗體,每周2次,分為手術(shù)7、14、28天,每時間點動物被處死6只。檢測肝臟再生指標;右肝+尾葉/總肝重量。
　　結(jié)果：
　　1.BMSCs移植組比對照組明顯提高了PVE后14天、28天

12、肝右葉+尾狀葉/總肝重量的比值(67.05±8.13versus54.67±8.23,p=0.026,71.77±4.06versus63.63±7.03,p=0.043).
　　2.BMSCs移植組比對照組明顯提高了PVE后14天、28天Ki-67標記指數(shù)(27.50±3.78vs.21.00±2.37atday14,p=0.002;24.83±3.06vs.17.50±1.87atday28,p=0.001)。
　　3.

13、BMSCs移植組比對照組明顯提高了PVE后14天、28天血清白蛋白水平及降低了血清總膽紅素水平。
　　4.術(shù)后7天,ALT水平BMSCs組較對照組明顯降低,但術(shù)后28天BMSCs組較對照組明顯提高了ALT水平。術(shù)后7天AST水平兩組間無明顯差別,但術(shù)后14、28天,BMSCs組較對照組明顯提高血清AST水平。
　　5.術(shù)后14、28天,BMSCs組比對照組明顯降低了右肝內(nèi)膠原沉積。
　　6.術(shù)后28天,BMSCs移植明

14、顯提高了剩余肝臟內(nèi)HGF、VEGF、MMP-9及IL-10基因水平。
　　7.BMSCs在肝內(nèi)以時間依賴的順序表達了AFP、CK18、ALB。8.TGF-β明顯抑制了BMSCs的增殖活性。
　　9.TGF-β明顯抑制了BMSCs向肝細胞的分化。
　　10.TGF-β1單克隆中和抗體抗體及BMSCs的聯(lián)合應(yīng)用較單獨移植BMSCs,不能明顯提高了肝右葉+尾狀葉/總肝重量的比值。
　　結(jié)論：
　　1.BMSCs能

15、夠在體內(nèi)分化為肝細胞。
　　2.BMSCs能夠緩解肝硬化。
　　3.自體BMSCs移植能明顯提高肝硬化肝臟PVE后剩余肝臟再生。
　　4.可能機制是BMSCs移植后肝細胞再生的微環(huán)境得到明顯改善,及通過改善肝硬化狀體,提高HGF、VEGF、MMP-9及IL-10;從而刺激內(nèi)源性的肝細胞增生。
　　5.TGF-β能明顯抑制BMSCs的增生。
　　6.TGF-β能夠明顯抑制BMSCs向肝細胞的分化。