骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及移植治療腦外傷患者的臨床觀察.pdf

1、顱腦外傷在神經(jīng)外科中常見(jiàn)，但其致殘率及致死率占全身各器官損傷之首。目前臨床的治療手段主要是通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及神經(jīng)康復(fù)理療促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)生及突觸的修復(fù)連接，但由于人腦已難以自我修復(fù)損傷神經(jīng)元及產(chǎn)生功能性神經(jīng)元，因而難以達(dá)到理想的療效；細(xì)胞移植為腦外傷治療提供了一種新的治療方法，即移植細(xì)胞后可補(bǔ)充或再生受損神經(jīng)細(xì)胞。由于神經(jīng)干細(xì)胞存在取材困難以及其自身具有向腫瘤細(xì)胞分化的潛在的特性，神經(jīng)干細(xì)胞的移植難以應(yīng)用于臨床，而骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在

2、體外一定條件下可向神經(jīng)細(xì)胞分化，包括神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元，同時(shí)具有取材方便，傳代穩(wěn)定等特點(diǎn)，因此應(yīng)用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療腦外傷成為顱腦外傷治療的希望。
　　血清是細(xì)胞培養(yǎng)的重要成分，對(duì)細(xì)胞的分裂增殖及生命活動(dòng)具有重要作用。但細(xì)胞分化對(duì)微環(huán)境的影響非常敏感，尤其在有血清培養(yǎng)體系的細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，血清濃度高低可能導(dǎo)致分化結(jié)果迥異。本研究通過(guò)對(duì)不同血清濃度下，誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的效率的比較，初步探討了微環(huán)境對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分

3、化的影響作用，發(fā)現(xiàn)低濃度血清對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化起促進(jìn)作用，而高濃度血清起抑制作用，為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外分化調(diào)控及臨床應(yīng)用提供重要資料。
　　1、人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、鑒定
　　目的通過(guò)穩(wěn)定可靠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，獲得大量骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。方法取志愿者骨髓Sml并于體外以密度為1.073g/mlPercoll分離液分離，吸取中間絮狀細(xì)胞層，以DMEM/F12+15％FBS進(jìn)行培養(yǎng)，48h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁，換液后

4、繼續(xù)培養(yǎng)，7-8天見(jiàn)細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底。結(jié)果7-8天后見(jiàn)細(xì)胞聚集成團(tuán)，柵欄狀、漩渦狀排列，細(xì)胞呈梭形、星形或三角形，CD34、CD105免疫組化染色顯示，CD34陰性，CD105陽(yáng)性。結(jié)論實(shí)驗(yàn)中原代培養(yǎng)細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、微環(huán)境對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響
　　目的：通過(guò)對(duì)不同血清濃度下，誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的效率的比較，探討如何提高人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化率。方法：體外培養(yǎng)獲得原代骨髓基質(zhì)

5、干細(xì)胞，鑒定后取第3代培養(yǎng)細(xì)胞，分別在1％，2％，5％，10％，15％，20％的血清濃度下用lOng/mlbFGF+lOng/mlEGF預(yù)誘導(dǎo)72h后，O.lumol/LRA、lOng/mlGDNF+lOng/mlBDNF正式誘導(dǎo)，并與無(wú)血清組比較，7天后進(jìn)行熒光免疫組化染色，分別檢驗(yàn)Nestin、NSE及GFAP的表達(dá)。
　　結(jié)果：各組經(jīng)正式誘導(dǎo)ld后有部分BMSC開(kāi)始收縮，細(xì)胞呈圓形，加血清組的BMSC生長(zhǎng)速度快，細(xì)胞核分裂相

6、多，部分細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，胞體呈錐形或圓形，有較長(zhǎng)單極或多極的突起。熒光抗體染色后熒光顯微鏡觀察到，2％血清組NSE、nestin顯色最多，GFAP最少。
　　結(jié)論：bFGF、EGF和RA、GDNF、BDNF可以聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，而2％血清濃度可起促進(jìn)作用，且神經(jīng)元分化率最高。
　　3、自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦外傷后神經(jīng)功能障礙患者治療作用的臨床觀察
　　目的：通過(guò)觀察自體骨髓基質(zhì)

7、干細(xì)胞移植對(duì)外傷后神經(jīng)功能障礙患者作用的效果，對(duì)細(xì)胞移植治療腦外傷的安全性及療效進(jìn)行分析，為細(xì)胞移植工作進(jìn)一步推廣奠定基礎(chǔ)。
　　方法：體外培養(yǎng)獲得原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，鑒定后取第3代培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)無(wú)菌測(cè)試合格，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，家屬簽字后，予1名外傷后植物生存狀態(tài)患者經(jīng)顱置入Ommaya囊，經(jīng)Ommaya囊注射骨髓基質(zhì)干細(xì)胞至側(cè)腦室，細(xì)胞濃度為lxlOe5個(gè)/ml，另外2名患者通過(guò)鞘內(nèi)注射干細(xì)胞的方法移植。
　　結(jié)果：移

8、植細(xì)胞一周后植物生存患者未出現(xiàn)發(fā)熱、癲癇等癥狀，肢體肌張力下降，持續(xù)一段時(shí)間后變高，3個(gè)月后四肢肌張力降低，眼球也由原來(lái)不能追蹤注視變?yōu)榭勺粉欁⒁?，頭顱CT檢查及PET-CT結(jié)果顯示：有患側(cè)顳葉有新生腦組織及腦組織的代謝。另2名患者移植后均出現(xiàn)不同程度的好轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為肌張力下降，肌力恢復(fù)。3名患者的腦脊液BDNF濃度均在術(shù)后1、3、5、7天逐漸升高，14天后下降。
　　結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療顱腦損傷后神經(jīng)功能缺失不僅在理論上