Kif2a基因沉默抑制舌鱗狀細胞癌生長轉移的研究.pdf

1、口腔粘膜的鱗狀細胞癌是最常見的口腔惡性腫瘤，是全球十大高發(fā)癌癥之一。近年來，口腔癌的發(fā)病率有逐年增高和年輕化的趨勢。其中舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，且惡性程度高，轉移率大，占人類惡性腫瘤死亡率的1％左右，其治療后的5年生存率約為30％～50％。腫瘤的復發(fā)、轉移是影響腫瘤患者預后不良的主要因素，因此對腫瘤侵襲轉移機制的研究將會為腫瘤的治療及腫瘤患者預后的改善提供重要的線索。
　　 研究表明在影響腫瘤侵襲轉移諸多因素中，細胞

2、骨架的改變在腫瘤細胞轉移過程中發(fā)揮重要作用，其中構成細胞骨架主要成分之一的微管的減少及解聚與惡性腫瘤的轉移潛能有關。微管(MT)是細胞骨架的主要成分之一，構成細胞的網狀支架，維持細胞形態(tài)；參與細胞內物質運輸、細胞的收縮與偽足運動及細胞器的位移，尤其是染色體的分裂和位移，需要在微管的幫助下進行。微管還與有絲分裂和減數分裂等生命活動密切相關。大多數微管處于動態(tài)的聚合和解聚及之間的隨機轉換狀態(tài)。在微管解聚和聚合過程中，驅動蛋白發(fā)揮重要作用。驅

3、動蛋白(Kinesin)是真核細胞中一類保守的具有ATP酶活性的微管馬達蛋白。它們可利用水解ATP產生的能量沿微管運動，參與細胞內多種重要的生命活動，包括膜性細胞器、蛋白質、mRNA的運輸等。Kinesin-13是驅動蛋白家族中的一類特殊的蛋白質，具有解聚微管的作用，在哺乳動物中可以分為3個亞家族：Kif2a、Kif2b和Kif2c。研究顯示，Kif2a定位于中心體，因此可能參與中心體的移動過程。Homma等采用啟動子捕獲策略(prom

4、oter trap strategy)建立Kif2a敲除小鼠模型，通過遷移率統(tǒng)計分析顯示，與對照組相比，Kif2a敲除組小鼠出現大腦神經元遷移延遲、腦組織板層缺失及神經核定位錯誤等現象，提示Kif2a缺失可影響神經元的遷移能力。由此可以推測Kif2a缺失可能通過改變神經元胞體的微管動力學，而最終導致了神經元遷移缺陷。
　　 在細胞有絲分裂期，Kif2a主要定位于紡錘體極并參與細胞內雙極紡錘體的組裝及姐妹染色體的分離；Neil.J

5、 Ganem、Zhu等采用RNAi技術分別沉默人U2OS細胞及HeLa細胞中的Kif2a基因，導致細胞有絲分裂期單極紡錘體形成，從而證實Kif2a對細胞雙極紡錘體的形成是必需的。同樣，Jedidiah Gaetz等將Kif2a單克隆抗體加入蟾蜍卵細胞中，結果出現微管束延長的單極紡錘體?；诖?，可以推測阻斷Kif2a的表達有助于阻止惡性腫瘤細胞內紡錘體的正常形成，使染色體不能正常地分離，從而抑制增殖旺盛的惡性腫瘤細胞。
　　 鑒于

6、以往研究顯示的Kif2a在細胞分裂過程中紡錘體形成及細胞運動過程中骨架的改變中的重要作用，推測其在惡性腫瘤中可能存在異常表達并與腫瘤細胞侵襲遷移存在相關性。而目前，關于Kif2a在惡性腫瘤中的表達及其與腫瘤的侵襲轉移、預后的關系的研究尚未見報道。為了明確Kif2a在舌鱗狀細胞癌中的表達，本實驗從蛋白水平檢測舌鱗狀細胞癌組織中Kif2a的表達并探討其臨床意義。應用針對Kif2a的siRNA質粒沉默舌鱗狀細胞癌細胞Tca8113細胞中Kif

7、2a的表達，研究Kif2a基因對細胞增殖、凋亡及侵襲遷移能力的影響。此外，還通過基因芯片技術研究了Kif2a基因沉默后Tca8113細胞全基因組表達譜的變化，從中找到差異顯著的基因并加以驗證，分析Kif2a基因沉默抑制舌癌生長轉移的分子機制，以探討其作為舌癌生物和基因治療潛在分子靶點的可能，為舌癌治療提供新的有效的治療策略。
　　 第一部分Kif2a在舌鱗狀細胞癌中的表達及意義
　　 目的：研究微管解聚蛋白Kif2a在舌

8、鱗狀細胞癌中的表達及意義。
　　 方法：
　　 1.標本收集：收集2005～2008年山東大學口腔醫(yī)院44例舌鱗狀細胞癌住院患者的腫瘤標本?；颊甙凑漳挲g、性別、腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度、腫瘤有無淋巴轉移分類。診斷標準參考《頭頸部腫瘤病理和遺傳學》(世界衛(wèi)生組織分類及診斷標準)。所有患者術前均未行放療、化療以及其它干預治療，并同期行頸部淋巴結清掃術。
　　 2.應用免疫組化方法檢測Kif2a蛋白在舌鱗狀細胞癌、配

9、對癌旁組織及淋巴結轉移灶中的表達定位，并對免疫組化結果進行評分分析，評價Kif2a蛋白的表達與臨床資料之間的關系。
　　 結果：免疫組化結果顯示，44例舌癌原發(fā)灶與配對癌旁組織均見Kif2a陽性表達；其中與配對癌旁組織相比，70.5％(31/44)的舌癌原發(fā)灶高表達Kif2a。Kif2a蛋白主要表達在細胞質及胞核，呈棕黃色顆粒，在舌癌細胞胞漿中染色較強、棕黃色顆粒較粗大，而在癌旁組織細胞中染色較弱、黃色顆粒??；與配對舌癌原發(fā)灶相

10、比，70％(14/20)淋巴結內轉移灶癌細胞高表達Kif2a。Kif2a陽性表達主要定位于癌細胞胞漿及胞核內，呈深棕黃色、粗大顆粒。此外，Kif2a的表達在Ⅲ/Ⅳ期腫瘤細胞高于Ⅰ/Ⅱ期腫瘤細胞；在有淋巴結轉移的原發(fā)灶癌細胞高于無淋巴結轉移的原發(fā)灶癌細胞。Kif2a的表達與病人性別、年齡、腫瘤分級及組織學類型均無關。
　　 結論：Kif2a在舌鱗狀細胞癌中的存在異常表達，在癌旁組織弱表達；在淋巴結轉移灶癌細胞中的表達明顯強于原發(fā)灶

11、癌細胞。Kif2a的表達水平與腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移有關。Kif2a可作為評價舌鱗狀細胞癌預后的一個重要因子。
　　 第二部分Kif2a基因沉默對Tca8113細胞增殖、凋亡及侵襲遷移的影響
　　 目的：
　　 1.探討siRNA介導的Kif2a基因沉默對舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113細胞增殖、凋亡及侵襲遷移能力的影響。
　　 2.觀察化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)與Kif2a基因沉默對Tca81

12、13細胞增殖的共同作用。
　　 3.觀察Kif2a基因沉默對裸鼠舌癌移植瘤生長情況的影響。
　　 方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)：舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113細胞在37℃，5％CO2飽和濕度條件下，培養(yǎng)于含10％胎牛血清，100IU青霉素、100g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。
　　 2.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a質粒及pGPU6/GFP/Neo-NC質粒的構建：于文獻資料中檢索到Kif2a

13、的siRNA序列。靶序列為5‘-GGCAAAGAGAUUGACCUGG-3’將此片段設計為shRNA，并克隆入pGPU6/GFP/Neo載體(含有編碼綠色熒光蛋白GFP的基因)，命名為pGPU6/GFP/Neo-Kif2a。陰性對照靶序列為5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT3’，將此片段設計為shRNA，并克隆入pGPU6/GFP/Neo載體，命名為pGPU6/GFP/Neo-NC。siRNA質粒構建及重組質粒序列測定由上海吉

14、瑪公司完成。
　　 3.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a基因干擾效率的檢測：將對數生長期的Tca8113細胞以2×105數目接種于6孔培養(yǎng)板中。當細胞融合率達到70％左右，用脂質體liPofectamine2000轉染細胞。將細胞分為實驗組、陰性對照組、空白對照組，分別轉染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a、pGPU6/GFP/Neo-NC及空脂質體。
　　 轉染后48h，收集細胞，提取細胞總RNA，應用RT-

15、PCR方法檢測不同實驗組中Kif2a的基因表達。轉染后72h，收集細胞，提取細胞總蛋白，應用Western-blot方法檢測不同實驗組中Kif2a的蛋白表達。分析三個不同實驗組中Tca8113細胞Kif2a的基因、蛋白表達情況。評價pGPU6/GFP/Neo-Kif2a基因干擾效率。
　　 4.重組質粒穩(wěn)定轉染舌鱗癌細胞系的建立及其鑒定：經脂質體介導分別將pGPU6/GFP/Neo-Kif2a、pGPU6/GFP/Neo-NC轉

16、染Tca8113細胞，經G418穩(wěn)定篩選，建立穩(wěn)定敲除Kif2a基因的細胞模型。轉染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a的陽性克隆命名為Kif2a干擾組(Tca8113-Kif2a)，轉染pGPU6/GFP/Neo-NC的陽性克隆命名為NC對照組(Tca8113-NC)。采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光判定質粒轉染效率，通過Weatern blot方法檢測上述各組細胞中Kif2a的表達情況，鑒定Kif2a穩(wěn)定敲除的細胞模型。
　　

17、5.MTT法檢測Kif2a基因沉默對Tca8113細胞增殖的影響：取指數生長期Tca8113-Kif2a、Tca8113-NC及Tca8113細胞消化計數后按5×103個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)9天，于第1、3、5、7、9天采用MTT方法檢測各組細胞增殖情況。
　　 6.MTT法檢測5-Fu與Kif2a基因沉默對Tca8113細胞增殖活性的共同影響：取指數生長期Tca8113-Kif2a、Tca8113-NC及Tca8

18、113細胞消化計數后按5×103個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度5-Fu，培養(yǎng)4天后采用MTT方法檢測各組細胞增殖情況。
　　 7.克隆形成實驗檢測Kif2a基因沉默后 Tca8113細胞克隆形成能力：20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液與1.2％的低熔點瓊脂糖混合作底層瓊脂，各組1×105個細胞與0.6％的瓊脂糖混勻，注入鋪有1.2％瓊脂糖底層平皿中，形成雙瓊脂層。置入37℃5％CO2溫箱中培養(yǎng)14天，在倒置

19、顯微鏡下，觀察細胞克隆數。計算形成率。
　　 8.流式細胞儀檢測Kif2a基因沉默對Tca8113細胞凋亡率的影響：取各組細胞消化計數后按2×105/孔接種于6孔板中，待細胞融合至約80％，收集細胞，AnnexinV/PI染色后流式細胞儀檢測細胞凋亡率變化。
　　 9.Transwell小室方法觀察Kif2a基因沉默對Tca8113細胞侵襲遷移能力的影響：取各組無血清Tca8113細胞懸液100μl(1×105個細胞)加

20、入小室的上室，下室加入600μ l含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)20h。光鏡下計數侵襲到濾膜背面的穿膜細胞數，評價細胞的侵襲能力。
　　 10.裸鼠背部舌癌腫瘤模型的建立及其生長情況：調整各組細胞懸液濃度為2×106個/ml備用。4周齡的BALB/c nu/nu雄性裸鼠共15只，隨機分成干擾組(Tca8113-Kif2a)、陰性對照組(Tca8113-NC)、空白對照組(Tca113)3個組(每組5只)。乙醚吸入麻醉后，

21、將以上3組 Tca8113細胞懸液100μl分別注射于對應3個組裸鼠的背部皮下。每天觀察腫瘤生長情況，每4天用游標卡尺測量一次腫瘤直徑，計算腫瘤體積并繪制腫瘤的生長曲線。接種35天后脫頸處死三組裸鼠，剝離腫瘤，測量瘤體積、稱量瘤重。
　　 結果：
　　 1.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a能夠有效下調Kif2a的表達：質粒轉染后48h，干擾組 Tca8113細胞Kif2a mRNA的表達均較陰性對照組下降90％，轉

22、染后72h，干擾組Tca8113細胞Kif2a蛋白表達亦顯著下調。
　　 2.pGPU6/GFP/Neo-NC及pGPU6/GFP/Neo-Kif2a中含有編碼綠色熒光蛋白GFP的基因，穩(wěn)篩成功的細胞在熒光顯微鏡下觀察可發(fā)出綠色熒光。Western Blot檢測結果顯示，與對照組Tca8113-NC相比，Tca8113-Kif2a組細胞Kif2a的蛋白表達下調76.5％。
　　 3.應用MTT法檢測Kif2a基因沉默后T

23、ca8113細胞增殖活性，結果發(fā)現種板后第1、2天，三組Tca8113細胞的增殖活性未見明顯差異，第3天開始，干擾組細胞的增殖活性與陰性對照組相比出現降低，統(tǒng)計學上有顯著性差異。
　　 4.5-Fu作用4天后，MTT法檢測各組細胞的增殖情況，結果顯示，與對照組相比，Tca8113-Kif2a細胞增殖活性顯著下降，5-Fu的半數抑制率IC50顯著降低，Kif2a基因沉默能顯著增強5-Fu對Tca8113細胞的增殖抑制效應，增加Tc

24、a8113細胞對5-Fu的藥物敏感性。
　　 5.克隆形成實驗結果顯示，與對照組Tca8113-NC相比，Tca8113-Kif2a組細胞克隆形成數目明顯減少。
　　 6.流式細胞術結果顯示，Tca8113-Kif2a細胞凋亡率為28.94％，與陰性對照組比較有顯著性差異。
　　 7.Transwell實驗結果發(fā)現，與陰性對照組相比干擾組穿過濾膜的Tca8113細胞數量明顯減少，而陰性對照組與空白對照組相比無明顯

25、差異。
　　 8.三組腫瘤細胞注射裸鼠背部皮下后，在局部形成水腫，4天后即可觸及腫瘤硬結。腫瘤持續(xù)生長，開始呈圓形或者橢圓形，后來可呈結節(jié)狀?？瞻捉M與陰性對照組腫瘤體積無明顯差異，但Tca8113-Kif2a組生長相對較慢，12天后各組裸鼠移植瘤的體積出現差異，35天處死裸鼠，Tca8113-Kif2a腫瘤體積、重量均明顯小于Tca8113-NC組。
　　 結論：
　　 1.pGPU6/GFP/Neo-Kif2a

26、能夠有效地抑制Tca8113細胞中Kif2a的表達，Kif2a基因沉默后Tca8113細胞增殖、凋亡及侵襲能力明顯降低；Kif2a基因沉默能夠抑制裸鼠移植瘤的生長。
　　 2.Kif2a基因沉默能顯著增加化療藥物5-Fu對細胞增殖的抑制效應，提高Tca8113細胞對藥物的敏感性，為舌癌化療提供了新的思路。
　　 3.Kif2a是基因治療舌鱗狀細胞癌的理想靶基因。
　　 第三部分Kif2a基因沉默對Tca8113細

27、胞全基因組表達譜變化的影響
　　 目的：
　　 1.分析Kif2a基因沉默對Tca8113細胞全基因組表達譜變化的影響，篩選與Kif2a信號通路有關的差異基因，以便更好地認識Kif2a信號通路的傳導過程及其在舌癌細胞增殖、凋亡、侵襲遷移調控中的作用機制。
　　 2.探討Kif2a基因作為靶基因抑制舌鱗狀細胞癌生長、侵襲及轉移的分子機制。
　　 方法：
　　 1、基因芯片技術研究Kif2a基因沉默對

28、Tca8113細胞全基因組表達譜變化的影響：收集對數生長期各組細胞5×106個，加Trizol提取總RNA，進行基因芯片分析(上?？党缮镉邢薰?。使用GenePix4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度。采用LuxScan3.0圖像分析軟件(CaPitalBio公司)對芯片圖像進行分析處理，熒光染料cy3的信號用綠色表示，cy5的信號用紅色表示。整合兩張芯片熒光強度的比值，即Ratio值，以整合后的Ratio值≥12.0或≤0.5為

29、標準確定差異表達基因，其中Ratio值≥12表示基因表達上調，Ratio值≤0.5表示基因表達下調。
　　 2.差異表達基因的通路分析及差異表達基因的驗證：利用Biorag數據庫基因通路分析工具，對差異表達基因進行分析。并應用實時定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)技術對其中幾個重要的差異表達基因進行驗證。實驗數據經看家基因歸一化后，將通過real time RT-PCR檢測得到的差異表達基因的Ratio值與芯片檢測得

30、到的Ratio值進行比較，以評價芯片檢測結果的可靠程度。
　　 結果：
　　 1.基因芯片掃描結果顯示信號清晰，富有層次，且背景均勻：黃色為Tca8113-Kif2a和Tca8113-NC兩種細胞共同表達的基因，紅色為Tca8113-Kif2a細胞過表達的基因，綠色為Tca8113-NC細胞過表達的基因，重復實驗效果良好。
　　 2.基因表達譜分析比較，Tca8113-Kif2a與 Tca8113-NC之間共有2

31、093個存在顯著差異表達的基因。其中在干擾組明顯上調的基因主要包括細胞因子/趨化因子及其受體類9個，細胞骨架/ECM調節(jié)因子類9個，脂質代謝類類5個，細胞表面分子/受體類3個，轉錄因子類10個及其他類12個；明顯下調的基因主要包括細胞因子/趨化因子及其受體類2個，細胞骨架/ECM調節(jié)因子類4個，脂質代謝類類2個，細胞表面分子/受體類4個，轉錄因子類3個及其他類3個。
　　 3.差異表達基因的通路分析結果顯示差異表達的基因涉及多個

32、通路，主要包括細胞周期/有絲分裂、細胞凋亡以及PI3K/Akt信號轉導通路。
　　 4.Real time RT-PCR驗證結果顯示，PI3K、Akt、Bcl-2，Bax和MMP-9基因的Ratio值與芯片檢測得到的Ratio值接近，證實本研究中基因芯片檢測得到的結果能較好地反映基因差異表達的趨勢，結果較可靠。
　　 結論：
　　 1.Kif2a基因沉默可導致Tca8113細胞全基因組中部分基因的變化，并涉及多個