RNA干擾抑制肺鱗狀細(xì)胞癌NCI-H520細(xì)胞CAR基因表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立RNA干擾(RNAinterference，RNAi)抑制柯薩奇病毒腺病毒受體(coxsackievirusandadenovirusreceptor，CAR)基因表達(dá)的肺癌NCI-H520穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，通過(guò)平板克降形成實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)初步探討CAR失表達(dá)對(duì)人肺鱗狀細(xì)胞癌NCI-H520細(xì)胞增殖與侵襲遷移的影響。
　　方法：
　　1將針對(duì)CARmRNA序列設(shè)計(jì)的三個(gè)小干擾RNA重組質(zhì)粒分別以

2、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人肺鱗狀細(xì)胞癌NCI-H520細(xì)胞，并經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　2采用半定量RT-PCR和Westernblot檢測(cè)3個(gè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系和陰性對(duì)照、空白對(duì)照組細(xì)胞中CARmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，判斷抑制效果并篩選出抑制效果最佳的一組穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
　　3用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)觀察RNA干擾抑制CAR基因表達(dá)對(duì)NCI-H520肺癌細(xì)胞增殖與侵襲遷移的影響。
　　

3、結(jié)果：
　　1篩選得到三組抑制CAR基因表達(dá)的NCI-H520穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　2半定量RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，三組穩(wěn)定細(xì)胞系中CARmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均有不同程度的下降。其中shRNA-2抑制作用最強(qiáng)，其對(duì)CARmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制率分別達(dá)到82.5％和79.8％。
　　3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，shRNA-2抑制CAR基因表達(dá)后NCI-H520細(xì)胞的增殖能力有所下降，但是其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

4、義(P>0.05)，transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)顯示NCI-H520細(xì)胞侵襲遷移能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1篩選出了抑制CAR基因表達(dá)效果最佳的一組shRNA，并建立了能穩(wěn)定而有效抑制CAR基因表達(dá)的肺鱗狀細(xì)胞癌NCI-H520細(xì)胞系。
　　2抑制CAR基因表達(dá)后，NCI-H520細(xì)胞侵襲及遷移能力顯著受到了抑制，初步證實(shí)了CAR在肺癌細(xì)胞侵襲遷移過(guò)程中的重要作用。