人EGFR顯性負性突變體對胃癌抑制作用及其分子機制的實驗研究.pdf

1、重慶醫(yī)科大學博士學位論文人EGFR顯性負性突變體對胃癌抑制作用及其分子機制的實驗研究姓名：廖剛申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（胃腸外科）指導教師：王子衛(wèi)20100501重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文( 3 ) 應用p E G F P N l - D N E G F R 在脂質(zhì)體介導下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株S G C ．7 9 0 1 、N C I - N 8 7 ，應用W e s t e r n b l o t t i n g 檢測D N

2、 E G F R —E G F P蛋白的表達，光譜激光掃描共聚焦顯微鏡對D N E G F R - E G F P 亞細胞結(jié)構(gòu)定位檢測，并且R T - P C R 、W e s t e r n b l o t t i n g 檢測D N E G F R - E G F P 對內(nèi)源性E G F R m R N A 水平、蛋白及磷酸化水平的影響。( 4 ) 應用M T T 法、流式細胞術(shù)、T U N E L 法、劃痕實驗、細胞粘附實驗、體外

3、侵襲實驗、H U V E C 管腔結(jié)構(gòu)形成實驗、裸鼠皮下移植瘤模型、微血管計數(shù)檢測D N E G F R ．E G F P 對胃癌細胞惡性表型的作用，W e s t e r n b l o t t i n g 、E L I S A 檢測相關蛋白明確分子機制。結(jié)果：( 1 ) 胃癌組織中E G F R 陽性表達率為4 8 ．3 ％，其陽性表達與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T N M 分期相關。( 2 ) P C R 擴增鑒定、雙酶切鑒定、核苷酸

4、序列測定以及生物信息學分析證實p E G F P N l 一D N E G F R 構(gòu)建成功，并且W e s t e r nb l o t t i n g 檢測D N E G F R - E G F P 蛋白的表達，光譜激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示D N E G F R - E G F P 蛋白主要定位于細胞膜。( 3 ) W e s t e r n b l o t t i n g 檢測到胃癌細胞中D N E G F R - E G F

5、 P 蛋白的表達，光譜激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示D N E G F R - E G F P 蛋白主要定位于細胞膜，D N E G F R ．E G F P 降低內(nèi)源性E G F R 蛋白磷酸化水平，而對內(nèi)源性E G F R m R N A 水平及蛋白水平無影響。( 4 ) D N E G F R - E G F P 通過下調(diào)C D K 2 、C y c l i n D 1 、p G S K - 3 9 ( s e r9 ) ，上調(diào)p