新型Survivin顯性負突變體D71A抑制前列腺腫瘤細胞體內(nèi)外生長的實驗研究.pdf

1、前列腺癌發(fā)病率的持續(xù)增長和死亡率的增加是近年來困擾大家的一個公眾問題。在歐美國家，前列腺癌是男性病死率占第二位的惡性腫瘤。近年來盡管在前列腺癌的診斷、治療方面取得了一些進展，但像前列腺癌的病因、預(yù)防和治療還存在很多問題，相對其他大多數(shù)腫瘤，我們對前列腺癌的了解還是遠遠不夠。因此，尋找一種特異性較高的前列腺癌腫瘤標記物或癌基因?qū)η傲邢侔┑脑\斷治療有很大的意義。
　　研究表明，腫瘤細胞凋亡的減少與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的密切相關(guān)。并且使細胞

2、耐受放療、化療的刺激。因此，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡成為了一種新的殺傷腫瘤細胞的治療策略。Survivin定位于17q25，是一個凋亡抑制基因，屬于IAP家族。它編碼142氨基酸殘疾16.5KD的胞漿蛋白，survivin具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞分裂的雙重功能，它抑制凋亡的作用是通過與凋亡效應(yīng)分子caspase3、7直接結(jié)合實現(xiàn)的。Survivin主要表達在細胞周期的G2/M期，結(jié)合與有絲分裂期的微管，不僅參與細胞漿分裂，而且參與細胞有絲分裂

3、的其它諸多方面。分析其表達譜發(fā)現(xiàn)，survivin在胚胎和幾乎所有的腫瘤組織中表達，survivin已成為診斷和評價預(yù)后的標志物。由于它特異性的表達與促進腫瘤生長的功能，使之成為腫瘤治療的新靶點。
　　目的：1.建立一種新型安全有效的前列腺癌基因治療體系；2.研究Survivin-D71A突變基因在體外對前列腺癌PC3、DU145、LNcap細胞株的凋亡作用的影響。3.研究Survivin-D71A突變基因在荷前列腺癌裸鼠體內(nèi)對實

4、體腫瘤的實驗治療作用。
　　方法：①重組PCR法克隆Survivin-D71A全長cDNA,構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體pshuttle-Survivin-D71A，并與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdessy-1以電穿孔法在BJ5183菌中同源重組，獲得重組腺病毒載體rAdeno-Survivin-D71A。將線性化的rAdeno-Survivin-D71A以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染QBI-293A細胞，制備和純化復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-Survivin-

5、D71A。②細胞計數(shù)、DAPI染色法、流式細胞法和Western印跡實驗評估Ad-Survivin-D71A對前列腺癌細胞的誘導(dǎo)凋亡作用。③將Ad-Survivin-D71A感染前列腺癌細胞分別接種于裸鼠背部皮下，建立前列腺癌裸鼠皮下移植模型，定期觀察腫瘤生長情況，測定腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。④將前列腺癌細胞分別接種于裸鼠背部皮下，建立前列腺癌裸鼠皮下移植模型，采取瘤體直接注射的方法將表達Survivin-D71A的重組腺病毒直接導(dǎo)

6、入瘤體，定期觀察腫瘤生長情況，測定腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。
　　結(jié)果：①構(gòu)建含完整表達框的重組腺病毒穿梭載體pshuttle-CMV-Survivin-D71A。pshuttle-CMV-Survivin-D71A與pAdessy-1同源重組，獲得重組腺病毒載體rAdeno-Survivin-D71A。線性化的rAdeno-Survivin-D71A在QBI-293A細胞中包裝、擴增、純化、濃縮，經(jīng)TCID50法測定，獲得滴度

7、約為1×1010pfu/mL的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-Survivin-D71A。②細胞計數(shù)結(jié)果顯示Ad-Survivin-D71A組腫瘤細胞生長增殖能力較對照組明顯降低；DAPI染色顯示，Ad-Survivin-D71A組中凋亡細胞明顯增多；流式細胞法檢測出明顯的凋亡峰，細胞周期也有所改變，與無任何處理的對照相比，G2-M期亞群減少，S期亞群增加。Western-blot證實Survivin表達受到明顯抑制。③在Ad-Survivi