姜黃素抗角膜基質(zhì)細胞纖維化的初步研究.pdf

1、角膜受到創(chuàng)傷或手術(shù)后,受損的上皮細胞誘導(dǎo)角膜淺基質(zhì)層細胞凋亡,新形成的角膜基質(zhì)膠原纖維紊亂排列,鄰近的角膜細胞活化并增殖為成纖維細胞,活化的成纖維細胞向傷口處移行,即構(gòu)成了不透明的角膜瘢痕組織,并完成角膜傷口愈合過程。其中活躍增生的角膜基質(zhì)細胞在纖維化過程中發(fā)揮重要作用。然而,角膜過度纖維化會導(dǎo)致瘢痕形成嚴重,降低角膜透明度,如瘢痕位于角膜中央,則會嚴重影響視功能。目前,用于控制角膜過度纖維化的藥物主要有皮質(zhì)類固醇和抗代謝藥物等,但由于

2、具有明顯的副作用而限制了它們的臨床應(yīng)用。因此,尋找安全有效的控制角膜基質(zhì)細胞過度纖維化的藥物一直是角膜創(chuàng)傷愈合研究和臨床工作中的重要課題。姜黃素(curcumin)是從姜科植物姜黃中提取的一種植物多酚,其藥理作用尤其抗纖維化作用逐漸引起人們的重視,成為研究熱點。有研究表明,姜黃素可明顯減輕肺纖維化、肝纖維化和腎纖維化程度[1],但有關(guān)姜黃素是否會影響角膜基質(zhì)細胞纖維化的研究尚少。本研究預(yù)培養(yǎng)離體小鼠角膜基質(zhì)細胞,并將不同質(zhì)量濃度的姜黃素

3、分別作用于小鼠角膜基質(zhì)細胞向角膜基質(zhì)成纖維細胞方向轉(zhuǎn)化的過程中,用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)法(reverse transcription PCR,RT-PCR)、MTS法及免疫熒光法等觀察不同質(zhì)量濃度姜黃素對這一過程的影響,以探討姜黃素的抗角膜基質(zhì)纖維化的作用,為角膜創(chuàng)傷后瘢痕愈合的臨床用藥提供參考。
　　 目的:觀察不同質(zhì)量濃度姜黃素對這一過程的影響,以探討姜黃素的抗角膜基質(zhì)纖維化的作用,為角膜創(chuàng)傷后瘢痕愈合的臨床用藥提供參考。<

4、br>　　 方法:
　　 1:選取清潔級健康BALB/c小鼠,6-8周齡,體重25～30g,雌雄不限,無眼部疾病。將小鼠斷頸處死,眼球剜出后置于含4 g/L慶大霉素的PBS中浸泡15 min。無菌環(huán)境下,將角膜沿角鞏膜緣剪下,置于含20 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA NA2)的PBS中,37℃條件下孵育45 min。手術(shù)顯微鏡下,用顯微鑷子撕除角膜上皮以及內(nèi)皮后,將角膜基質(zhì)置于含3×105U/LⅠ型膠原酶的DMEM中,3

5、7℃條件下消化4 h后離心,再將角膜基質(zhì)細胞重懸于DMEM中。在光學(xué)顯微鏡下觀察該原代角膜基質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)特征。
　　 2:以原代角膜基質(zhì)細胞為受試對象,DMEM+10％FBS做為誘導(dǎo)劑,將原代角膜基質(zhì)細胞以相同數(shù)量級(5×104個/L)培養(yǎng)于以下五組培養(yǎng)液中:(1)對照組:即角膜基質(zhì)細胞誘導(dǎo)組(DMEM+10％FBS,含1‰DMSO)。(2)低劑量組(DMEM+10％FBS+7.5 m/L姜黃素,含1‰DMSO)。(3)中劑量

6、組(DMEM+10％FBS+10 m/L姜黃素,含1‰DMSO)。(4)高劑量組(DMEM+10％FBS+12.5 m/L姜黃素,含1‰DMSO)。(5)E.無誘導(dǎo)劑組:即原代角膜基質(zhì)細胞組(DMEM,含1‰DMSO)。每3天換液一次,培養(yǎng)周期為7 d。藥物分別作用7天后,應(yīng)用RT-PCR法,分別提取以上五組細胞的RNA,并進行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。PCR擴增相關(guān)的細胞標(biāo)志性基因:角膜蛋白多糖(keratoean)、醛脫氫酶(aldehy

7、de dehydrogenase,ALDH)、CD90、decorin、fibronectin-1(引物見表1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后成像。觀察不同質(zhì)量濃度姜黃素作用下各細胞表型表達的變化趨勢。
　　 3:將原代角膜基質(zhì)細胞以5×104個/ml接種于96孔板中,以上述A、B、C、D組培養(yǎng)液作用7d后,每孔加入新配制的MTS20μl(5g/L),4 h后棄去上清,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長測定各孔的吸光度值(A

8、490)。每組設(shè)平行復(fù)孔6個,重復(fù)實驗3次。計算上述各組中姜黃素對角膜基質(zhì)細胞增生的抑制率(％)=(1-實驗組A490/對照組A490)×100％,并進行比較。上述實驗組在進行藥物干預(yù)前均用錐蟲藍染色,對活細胞率進行檢測,以觀察姜黃素的細胞毒性。
　　 4:角膜標(biāo)本取出后立即經(jīng)OCT包埋并切片(厚度為5μm),冷丙酮固定10 min后風(fēng)干,PBS沖洗3次,10％山羊血清封閉40 min,以兔抗鼠fibroneetin-1抗體(1

9、:50)4℃孵育過夜后用PBS沖洗3次,熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG于37℃孵育30 min后用PBS沖洗3次,Hoechest33442(1:500)孵育1 min后用PBS沖洗,防褪色封片劑封片。以PBS代替兔抗鼠fibronectin-1抗體,作為陰性對照。應(yīng)用熒光顯微鏡進行觀察。
　　 5:實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1:小鼠角膜基質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)特征以及鑒定小鼠角膜基

10、質(zhì)經(jīng)膠原酶消化后離心,可得到單個細胞。光學(xué)顯微鏡下觀察原代角膜基質(zhì)細胞,可見其胞體較小,呈圓形或多角形,并伸展出細長的突觸,呈現(xiàn)出典型的樹狀骨針樣、類似于神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征。
　　 2: RT-PCR法檢測結(jié)果顯示,小鼠角膜基質(zhì)細胞keratocan和ALDH呈高表達,decorin呈低表達,不表達CD90;角膜基質(zhì)成纖維細胞高表達CD90和decorin,低表達ALDH,不表達keratocan。隨著加入姜黃素質(zhì)量濃度的遞增,

11、上述實驗組中keratocan和ALDH的mRNA表達量逐漸升高,CD90和decorin的mRNA表達量逐漸降低,均呈明顯的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系,與各自對照組相比且組間相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=210.78,F=292.57,F=1194.79,F=736.48,P＜0.05)。小鼠角膜基質(zhì)細胞和角膜基質(zhì)成纖維細胞均高表達fibronectin-1,但隨著質(zhì)量姜黃素濃度的升高,fibronectin-1的mRNA表達量無明顯變化,與對

12、照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3: MTS法檢測結(jié)果表明,隨著姜黃素質(zhì)量濃度的遞增,其對角膜基質(zhì)細胞增生的抑制率逐漸增加,各組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。錐蟲藍染色顯示各組活細胞率均在90％以上,各組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4:免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)細胞表達fibronectin-1。
　　 結(jié)論:姜黃素對離體小鼠角膜基質(zhì)細胞纖維化有明顯的抑制作用,可