姜黃素對腎小管間質(zhì)纖維化的干預(yù)及其機(jī)制研究.pdf

1、腎纖維化是所有腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎功能衰竭的共同病理途徑，大量動物和臨床試驗(yàn)表明，腎功能的惡化取決于腎小管間質(zhì)損傷的程度和范圍，腎小管間質(zhì)纖維化(Tubulointerstitial Fibrosis，TIF)程度是反映腎功能下降和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)。目前全世界終末期腎功能衰竭(End stage Renal Disease，ESRD)的患者以每年7％的速度遞增，給家庭及社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。進(jìn)一步研究TIF的分子機(jī)制，探索有效

2、的防治措施，對延緩ESRD的進(jìn)程意義重大。TIF是以腎小管萎縮，間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellularMatrix，ECM)過度積聚為特征的病理改變。腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial Mesenchymal Trailsition，EMT)在TIF進(jìn)程中的作用日益受到重視。許多證據(jù)表明轉(zhuǎn)化生長因子-β(Ttansforming Growth Factor-β，TGF-β)是最重要的致纖維化細(xì)胞

3、因子，始動并調(diào)節(jié)EMT及TIF的全過程，smads蛋白是TGF-β細(xì)胞內(nèi)信號傳遞分子，當(dāng)TGF-β與其受體結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)smad2，smad3并使之進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與其它轉(zhuǎn)錄活化因子一起，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前，防治腎纖維化尚缺乏特異性的藥物。祖國醫(yī)藥在防治慢性腎病方面歷史悠久，在探索具有抗腎纖維化作用的有效方藥上取得了一定進(jìn)展，但大多未能闡明其作用機(jī)制，這種對作用機(jī)制的不甚了解也影響了中藥在CKD中的應(yīng)用推廣。尋找對RIF具有明確治療

4、效果的中藥并闡明其療效機(jī)制，是中藥開發(fā)、中醫(yī)現(xiàn)代化的一項(xiàng)重要內(nèi)容。姜黃素(curcurmin，二阿魏?；淄?是植物藥姜黃、郁金、莪術(shù)等的塊莖中提取出來的一種酚性色素，它是一類多效的天然活性物質(zhì)，來源廣泛，毒性極低，在抗腫瘤和清除氧自由基方面得到廣泛的應(yīng)用。姜黃素對腎間質(zhì)炎癥和纖維化的作用如何目前并不清楚，本研究通過體內(nèi)動物模型，體外細(xì)胞培養(yǎng)兩方面觀察姜黃素對腎間質(zhì)纖維化的影響及可能機(jī)制，為臨床防治腎間質(zhì)纖維化尋找新的途徑。本研究分為三

5、個部分：
　　 第一部分：姜黃素對單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)大鼠腎臟病變的影響。
　　 目的：觀察姜黃素對UUO大鼠腎臟病變的影響。
　　 方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(SOR)，UUO組，姜黃素治療組(Cur)。SOR組僅游離左側(cè)輸尿管后即縫合皮膚，UUO組和Cur組行左側(cè)輸尿管雙結(jié)扎，Cur組在UUO的基礎(chǔ)上以姜黃素液(50mg/Kg.d)腹腔內(nèi)注射，SOR和UUO組使用等量助溶劑(DMSO)腹腔內(nèi)

6、注射，3組分別于術(shù)后第3，7，14天各處死5只大鼠。處死前一天收集24h尿液，處死當(dāng)天收集靜脈血及腎組織標(biāo)本。測定左腎重，行生化指標(biāo)檢測；腎組織標(biāo)本行HE及Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理改變，評估腎小管損害及腎間質(zhì)纖維化程度；用免疫組化法觀察腎臟a-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscleactin，a-SMA)的沉積。
　　 結(jié)果：從大體標(biāo)本上看，Cur組在對應(yīng)時間點(diǎn)上梗阻側(cè)腎臟的腫大及積水程度較UUO組輕，色澤較

7、紅潤；3組間血清ALB，BUN，Scr及24h尿蛋白定量無顯著性差異；Cur組的腎小管間質(zhì)損害程度及炎細(xì)胞浸潤半定量分析顯著低于UUO組(P<0.05)；UUO組和Cur組梗阻腎a-SMA的表達(dá)隨梗阻時間延長而逐漸增多，Cur組a-SMA的表達(dá)在對應(yīng)時間點(diǎn)上較UUO組明顯減弱，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：姜黃素可顯著減輕UUO大鼠梗阻側(cè)腎臟腎小管間質(zhì)的纖維化程度和炎細(xì)胞浸潤，下調(diào)a-SMA的表達(dá)，對梗阻腎

8、腎間質(zhì)具保護(hù)作用。
　　 第二部分：姜黃素對腎小管上皮細(xì)胞a-SMA和PAI-1表達(dá)的影響。
　　 目的：探討姜黃素對人近端小管上皮細(xì)胞(HK-2)纖維化相關(guān)基因a-SMA和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)表達(dá)的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)HK-2，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成正常對照組，TGF-β1刺激組、姜黃素不同濃度干預(yù)組或姜黃素不同時間干預(yù)組。干預(yù)結(jié)束計(jì)數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞提取細(xì)胞RNA、細(xì)胞總蛋白及培養(yǎng)上清液，RT-PC

9、R、Western blot及ELISA法分別檢測a-SMA和PAI-1的核酸及蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：MTT法顯示姜黃素20μmol/L濃度范圍內(nèi)對HK-2細(xì)胞生長無影響，正常情況下HK-2僅少量表達(dá)α-SMA和PAI-1，TGF-β1(5 ng/ml)刺激下α-SMA mRNA和PAI-1mRNA的水平分別是刺激前的3.01倍和2.87倍，不同濃度姜黃素對α-SMAmRNA和PAI-1mRNA的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，以10μ

10、mol/L作用最為顯著(P<0.05)。10μmol/L的姜黃素作用不同時間對上述基因表達(dá)均有抑制作用(P<0.05)。Western Blot和ELISA結(jié)果顯示姜黃素可以抑制HK-2細(xì)胞α-SMA和PAI-1蛋白的表達(dá)，與TGF-β1組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：TGF-β1顯著上調(diào)HK-2細(xì)胞α-SMA和PAI-1的mRNA水平，而且誘導(dǎo)細(xì)胞α-SMA蛋白及培養(yǎng)上清PAI-1的大量表達(dá)，姜黃素能夠抑制TGF-β1刺激下

11、HK-2細(xì)胞α-SMA和PAI-1的核酸及蛋白表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的濃度和時間依賴性，初步顯示其抗纖維化效應(yīng)。
　　 第三部分：姜黃素對腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1/Smad信號通路的影響。
　　 目的：研究姜黃素對TGF-β1刺激的HK-2細(xì)胞中TGFβ1/smad信號通路的影響，以探討姜黃素抗纖維化的分子機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，Western Blot法檢測TGF-β1刺激下Smad2、Smad3

12、的磷酸化水平及核漿分布情況，再以姜黃素(不同濃度/不同時間)干預(yù)后觀察上述Smads蛋白的變化；觀察磷酸酶抑制劑Microcystin與姜黃素共育對Smad蛋白的影響。
　　 結(jié)果：5ng/ml TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞的Smad2，Smad3磷酸化，同時促使Smad2，Smad3從胞漿向胞核轉(zhuǎn)移。姜黃素干預(yù)可顯著抑制Smad2磷酸化，作用呈濃度依賴性，但對Smad3磷酸化無影響。姜黃素可部分抑制Smad2/3信號從胞漿轉(zhuǎn)入