EIF-5A2基因在結直腸癌、卵巢癌和膀胱癌中的臨床病理學意義及功能的初步研究.pdf

1、研究背景與目的：近年來細胞遺傳學的研究發(fā)現(xiàn)，在人類頭頸、食管、乳腺、肺、胃腸、卵巢、前列腺、和膀胱等眾多惡性上皮性腫瘤中存在染色體3q或3q部分區(qū)段的高頻擴增。提示在染色體3q的某些DNA擴增區(qū)存在一個或多個關鍵的癌基因，其擴增與表達異?？赡茉谀[瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。2001年，Guan等應用染色體微切割及篩選雜交技術，從卵巢癌細胞的3q26.2高擴增區(qū)段克隆了一個新的候選癌基因—eIF—5A2。由于該基因編碼的蛋白與真核翻譯起始

2、因子EIF—5A有82％的同源性，所以該基因被命名為eIF—5A2。以往的研究表明，eIF—5A基因在細胞生長和增殖中具有重要的作用；在HeLa細胞和中國倉鼠卵巢上皮細胞中，當EIF—5A蛋白被抑制時，其細胞生長與增殖受到明顯抑制，而且可以引發(fā)細胞的凋亡。我們在卵巢癌的前期體內外研究中發(fā)現(xiàn)，eIF—5A2基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的癌基因作用；EIF—5A2蛋白的過度表達與卵巢癌的惡性進展有明顯的相關性。由于結直腸癌和膀胱癌等許多

3、惡性上皮腫瘤中也存在3q或3q部分區(qū)段的高頻擴增，那么在結直腸癌和膀胱癌等惡性腫瘤中是否也存在著eIF—5A2基因的擴增與異常表達？其是否與腫瘤的惡性進展密切相關？能否成為評估腫瘤預后的新分子標記物？等等，目前國內外尚未見文獻報道。因此，本課題旨在探索eIF—5A2基因在結直腸癌、膀胱癌和卵巢癌中的擴增與表達情況及其臨床病理學意義；同時探討其在結直腸癌細胞中的癌基因作用。 材料和方法： 1.病例收集：收集中山大學附屬腫瘤

4、醫(yī)院、中山大學附屬第一醫(yī)院和廣東省人民人醫(yī)院1990年到2005年間的結直腸腫瘤、卵巢腫瘤和膀胱癌患者手術切除的石臘包埋組織標本及其相關的臨床病理學資料。在本研究選取的結直腸癌病例中，包括139例進行局部結直腸癌切除術的腫瘤組織和相應的癌旁正常粘膜組織；同時，收集了22例伴發(fā)的結直腸腺瘤的標本和42例結直腸癌轉移病灶標本。在選取的170例卵巢腫瘤病例中，包括有30例良性腺瘤、30例交界性腫瘤和110例惡性腫瘤；同時選取30例卵巢正常組織

5、作為對照。在膀胱癌病例的挑選中，選取了兩組接受不同治療方法的膀胱癌病例，一組為90例浸潤型膀胱癌和50例癌旁的正常膀胱粘膜組織，另一組為112例淺表性膀胱癌和30例相應的癌旁正常膀胱粘膜組織。另外，我們同時也收集了13對新鮮的淺表性(pTa/pT1)膀胱癌組織及其癌旁的正常粘膜組織。 2.方法：本研究中我們在構建組織芯片的基礎上，應用免疫組化、RT—PCR、蛋白印跡和熒光原位雜交的方法，檢測eIF—5A2基因在結直腸癌、卵巢癌和

6、膀胱癌中的表達與擴增，并結合腫瘤的臨床病理學和預后資料，分析它們之間的相關性。在eIF—5A2基因功能的體外研究中，我們設計并構建RNA干擾的體外表達質粒，轉染進入結直腸癌SW480細胞中并篩選穩(wěn)定表達的克隆。應用RT—PCR和蛋白印跡方法檢測mRNA和蛋白的表達，并利用MTT、Transwell侵襲小室和平板克隆等實驗方法研究細胞的增殖和體外侵襲浸潤的能力。 結果： Ⅰ．eIF—5A2基因在結直腸癌、卵巢癌和膀胱癌中的

7、表達與擴增及其臨床意義 1.結直腸癌：免疫組化結果顯示，分別有35.3％的結直腸腺瘤，53.2％的原發(fā)性結直腸癌和67.6％的轉移性癌組織出現(xiàn)EIF—5A2蛋白的過度表達；而全部的癌旁正常腸粘膜組織未發(fā)現(xiàn)EIF—5A2蛋白的過度表達。在本組結直腸癌中，EIF—5A2蛋白表達與腫瘤的淋巴血管浸潤，局部淋巴結轉移，以及遠處轉移均有顯著的相關性(P<0.05)。在伴隨淋巴血管浸潤的病例中，有61.2％的腫瘤存在EIF—5A2過度表達，

8、明顯高于無淋巴血管浸潤的腫瘤(36.6％)；而在伴有局部淋巴結轉移(pTN1-2)和遠處轉移(pM1)的病例中，分別有63.8％和74.2％的腫瘤出現(xiàn)EIF—5A2過度表達，其過度表達率也明顯高于無淋巴結轉移組(40.4％)和無遠處轉移組(46.3％)。另外，EIF—5A2的過度表達與腫瘤細胞的增殖(Ki—67)顯著正相關(P<0.05)。本組FISH檢測結果發(fā)現(xiàn)，在97例成功進行檢測和分析的結直腸癌病例中，有15例檢測到eIF—5A2

9、基因的擴增，其中13例存在EIF—5A2蛋白的過度表達。 2.卵巢癌：免疫組化結果發(fā)現(xiàn)，分別有6.7％的卵巢腺瘤，30.0％的卵巢交界性腫瘤，和52.7％的卵巢癌組織中出現(xiàn)EIF—5A2過度表達；而所有正常卵巢癌上皮組織則未發(fā)現(xiàn)該蛋白過度表達。相關性分析發(fā)現(xiàn)，本組卵巢癌組織中EIF—5A2蛋白表達與腫瘤的組織學類型、pT分期、pN分期，F(xiàn)IGO分期、以及細胞增殖(Ki—67)均有顯著的相關性(P<0.05)。進一步，我們對EIF

10、—5A2表達與患者預后進行了單因素生存分析，結果發(fā)現(xiàn)EIF—5A2過度表達組患者的平均生存時間(39.0月)明顯短于正常表達組(69.5月，P<0.001)。多變量的Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，EIF—5A2蛋白表達是判斷本組患者總生存率的獨立預后指標(P=0.043)。FISH檢測發(fā)現(xiàn)，本組卵巢癌中有15.9％(10/63)的病例存在eIF—5A2基因擴增，而且全部10例均存在EIF—5A2蛋白過度表達。 3.膀胱癌(浸潤性膀胱癌)：

11、在免疫組化和FISH檢測有效的膀胱癌中，分別有45.3％(39/86)和10.6％(5/47)的病例存在EIF—5A2蛋白過度表達和基因擴增。相關性分析發(fā)現(xiàn)，本組膀胱癌中EIF—5A2表達與患者的臨床病理特征(患者年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級)均無明顯相關性，但與腫瘤細胞的增殖則有顯著的相關性(P=0.007)。對EIF—5A2表達與膀胱癌患者的預后進行單因素生存分析，結果發(fā)現(xiàn)蛋白過度表達患者的平均生存時間(38.2月)顯著短于正常表

12、達的患者(52.9月，P＝0.001)。多變量的Cox回歸分析結果顯示，EIF—5A2蛋白表達(P=0.004)與腫瘤pT分期(P=0.005)均是評估患者總生存率的獨立預后指標。進一步，我們對不同分級和臨床分期的腫瘤進行了分層預后分析，結果顯示：EIF—5A2蛋白過度表達在G1/G2級(P=0.0009)，G3級(P=0.016)，pT1(P=0.0089)、pT2(P=0.0354)、pT3/4(P=0.0058)、pN0(P=0.

13、0039)、和pN1-2期(P=0.0093)的腫瘤中，均是評估腫瘤預后的有效指標。 4.膀胱癌(淺表性膀胱癌)：免疫組化結果顯示，在112例淺表性膀胱癌(pTa/pT1)病例中，有38例(33.9％)檢測到EIF—5A2的過度表達。相關性分析發(fā)現(xiàn)，本組膀胱癌中EIF—5A2表達與患者的年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級等臨床病理特征均無明顯相關性。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，EIF—5A2蛋白過度表達患者的術后無復發(fā)生存時間(22.2月)

14、和術后無進展生存時間(36.2月)均明顯短于正常表達組患者(31.6月，P=0.002和40.7月，P=0.004)。進一步多變量的Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，EIF—5A2蛋白過度表達是淺表性膀胱癌患者術后復發(fā)(P=0.002)和術后進展(P=0.007)的獨立預后指標。FISH檢測發(fā)現(xiàn)，本組膀胱癌中有5.1％(3/59)的病例存在eIF—5A2基因的低水平擴增(gain)，8.5％(5/59)的病例出現(xiàn)高水平擴增(amplification

15、)。另外，在13對新鮮的膀胱癌組織中，發(fā)現(xiàn)有8例(61.5％)存在eIF—5A2 mRNA的表達上調，其中4例(30.8％)同時存在蛋白的表達上調。 Ⅱ.RNA干擾eIF—5A2基因在結直腸癌SW480細胞中的表達對其增殖和侵襲能力的影響 1.篩選eIF—5A2基因沉然的穩(wěn)定細胞株：限制性酶切凝膠電泳和DAN測序結果表明，兩條沉()eIF—5A2基因的DNA序列成功連接到RNAi表達載體(pGPU6/GFP/Neo)上。

16、熒光顯微鏡結果表明，eIF—5A2基因沉()質粒shRNA-1和shRNA—2成功轉染SW480細胞，并獲得了穩(wěn)定轉染的克隆。RT—PCR和蛋白印跡實驗結果表明，在shRNA-1和shRNA—2穩(wěn)定轉染的兩組細胞中，與對照組相比eIF—5A2的mRNA表達分別下降了87.2％和79.5％，蛋白表達則分別下降了90.2％和76.3％。 2.沉()eIF—5A2基因對細胞生物功能的影響：在shRNA-1和shRNA—2穩(wěn)定轉染的兩組

17、細胞中，發(fā)現(xiàn)沉()eIF—5A2基因的表達明顯抑制了細胞的增殖、侵襲和克隆形成能力，并導致G1期細胞數(shù)的增多。 結論： 1.EIF—5A2蛋白過度表達與結直腸癌的淋巴結和遠處血道轉移均密切相關，可能在結直腸癌的轉移中發(fā)揮著重要的作用。 2.EIF—5A2蛋白在卵巢腫瘤中的表達隨腫瘤惡性程度的增加而表達上調，其過度表達與卵巢癌的局部浸潤和轉移密切相關，而且是判斷卵巢癌患者生存的獨立預后指標。 3.在膀胱癌中

18、，EIF—5A2蛋白表達與腫瘤患者的臨床病理學參數(shù)無關，但可以作為評估浸潤型膀胱癌整體生存的獨立指標；同時也是判斷淺表性膀胱癌患者術后復發(fā)與進展的獨立預后指標。 4.在結直腸癌、卵巢痛和膀胱癌中，eIF—5A2基因的擴增可能在其蛋白過度表達中起著重要的作用。 5.沉默eIF—5A2基因表達可明顯抑制結直腸癌細胞的增殖及其侵襲和轉移能力，并影響了細胞周期的進展；eIF—5A2基因在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用，并