細(xì)菌FimH蛋白在ANCA相關(guān)性血管炎中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)是自身免疫性系統(tǒng)性小血管炎(Small vessel vasculitis,SVV),因循環(huán)中存在 ANCA包括髓過氧化物酶抗體(myeloperoxidase, MPO)和蛋白酶3抗體(protease3,PR3)而命名,腎臟病

2、理主要表現(xiàn)為局灶壞死性腎小球腎炎(focal necrotizing glomerulonephritis,FNGN),伴新月體形成,病情進(jìn)展兇險,通常導(dǎo)致快速進(jìn)展的腎功能衰竭,愈后很差。人溶酶體膜蛋白-2(human lysosomal membrane proteins2,hLAMP-2)抗體是新近由Kain等報道的一種ANCA新亞型,與腎臟損傷高度相關(guān),其由細(xì)菌鞭毛FimH蛋白通過“分子模擬”(Molecular Mimicry,

3、 MM)機制致病,即革蘭氏陰性桿菌的鞭毛蛋白第72至80位氨基酸殘基多肽(FimH P72-80)與人LAMP-2第41至49位氨基酸殘基多肽(LAMP-2 P41-49)具有100％同源性,導(dǎo)致機體識別病原體FimH抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答,也直接作用于自身抗原LAMP-2蛋白,導(dǎo)致小血管及腎臟的壞死性病變。提示細(xì)菌入侵人體后,通過 FimH啟動針對LAMP-2的自身免疫是ANCA相關(guān)性FNGN發(fā)病機制的關(guān)鍵。
　　不同于Th1細(xì)胞與

4、Th2細(xì)胞,Th17細(xì)胞是新型的CD4+輔助性T細(xì)胞(T helper, Th)亞群,通過分泌白介素-17(interleukin-17,IL-17)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子,參與機體重要生理或病理進(jìn)程。Nogueira等研究發(fā)現(xiàn),急性期AAV患者血清IL-17A水平顯著升高,腎組織上可見IL-17大量表達(dá),血清IL-23及MPO和PR3特異性的Th17細(xì)胞數(shù)均增高,提示I

5、L-17在AAV的發(fā)生中起重要作用。無論在 ANCA陽性的血管炎患者,還是血管炎小鼠模型,均存在MPO-ANCA或PR3-ANCA特異性的Th17細(xì)胞克隆及反應(yīng),提示Th17細(xì)胞可能參與了ANCA相關(guān)的病理損傷。然而,細(xì)菌感染后如何激活宿主自身免疫,具體機制需要進(jìn)一步探索。含鞭毛蛋白(FimH)的細(xì)菌感染后,IL-17變化情況及其與腎臟損傷是否相關(guān),目前還未見報道。
　　LAMP-2抗體的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為開創(chuàng)了繼傳統(tǒng)ANCA的又一個新紀(jì)

6、元,但是否能成為臨床診斷 AAV的血清學(xué)標(biāo)志目前還存在爭議,其敏感性和特異性還需進(jìn)一步驗證。本研究擬從臨床出發(fā),通過診斷性試驗研究設(shè)計,探討LAMP-2抗體在本單中心對AAV的診斷價值;同時從發(fā)病機制出發(fā),構(gòu)建FimH融合蛋白表達(dá)載體并純化,聯(lián)合Titermax Gold佐劑,皮下免疫WKY大鼠,初步觀察大鼠腎小球損傷及血清IL-17A水平、與蛋白尿相關(guān)性等,進(jìn)一步探討感染與AAV自身免疫的可能機制。
　　方法:
　　1.

7、LAMP-2抗體在AAV中臨床價值評價按改進(jìn)的美國 Chapel Hill血管炎會議(CHCC)診斷標(biāo)準(zhǔn),篩選2010年09月至2013年06月,就診于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科的AAV新月體腎炎患者32例,其中28例腎活檢明確為新月體腎炎,以ANCA陰性其他腎小球腎炎42例為病例對照組;50例健康志愿者,為健康對照組。入院后收集各組血清,以健康志愿者血清光密度(optical density,OD)值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差(standard d

8、eviation,SD)作為參考值截止值(cut off值)。以重組人 LAMP-2/CD107b為包被抗原(R&D公司),間接ELISA法檢測血清LAMP-2抗體。參照試劑盒說明,采用歐蒙印跡法及間接免疫熒光法檢測 MPO、PR3及 GBM等(歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司)。列出診斷性實驗四格表,計算診斷評價指標(biāo):敏感度(sensitivity,Sen)、特異度(specificity, Spe)、陽性預(yù)測值(positive predict

9、ive value,PPV)、陽性似然比(positive likelihood ratio, PLR)、陰性預(yù)測值(negative predictive value, NPV)、陰性似然比(negative likelihood ratio, NLR)及約登指數(shù)(Youden index, YI)等。
　　2. FimH1-156融合蛋白的制備 PCR法克隆pPKL241質(zhì)粒獲取FimH1-156基因,插入原核表達(dá)載體pET2

10、8a(+);將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)FimH融合蛋白,超聲裂解細(xì)菌,Ni-NTA層析法進(jìn)行純化,SDS-PAGE分析、Western印跡法對其進(jìn)行鑒定。LAMP-2表位肽P41-49的合成及鑒定由杭州中肽生物有限公司合成,并經(jīng)質(zhì)譜鑒定,純度大于95%。
　　3. FimH1-156融合蛋白及LAMP-2表位肽P41-49誘導(dǎo)的病理模型:融合蛋白模型組:采用純化的大腸桿菌 FimH

11、融合蛋白(150μg)聯(lián)合 Titermax金佐劑(150μl)皮下注射免疫Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,融合蛋白對照組:采用PBS(150μl)+Titermax金佐劑(150μl)。多肽模型組:采用完全弗氏佐劑聯(lián)合LAMP-2表位肽P41-49免疫WKY大鼠,在每只 WKY大鼠尾根部皮下注射600μl雞尾酒式乳化液:內(nèi)含300μl完全弗氏佐劑以及300μl雙蒸水溶解的0.3mg LAMP-2多肽P41–49。多肽對照組:大

12、鼠采用雙蒸水代替多肽免疫大鼠。監(jiān)測各時間點(0、3、7、14、21、28、35、50天)大鼠24小時尿蛋白總量的變化,于免疫后21天、35天和50天檢測大鼠血清尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)水平,觀察腎、肺組織病理變化,ELISA法檢測血清IL-17A水平。
　　結(jié)果:
　　1.2010年9月至2013年6月期間,符合納入標(biāo)準(zhǔn)的AAV新月體腎炎患者32例,其他腎小球腎炎42例。50名健康志愿者來自新橋醫(yī)院

13、健康體檢中心。在32例AAV中,30例檢出LAMP-2抗體陽性。而在42例疾病對照組中,7例檢出陽性。其中ANCA陰性、其他自身抗體陰性的新月體腎炎檢出LAMP-2抗體的4例。健康對照組無陽性抗體檢出。列出診斷性實驗四格表后,計算出其敏感度(Sen)、特異度(Spe)、陽性預(yù)測值(PPV)、陰性預(yù)測值(NPV)、陽性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)及約登指數(shù)(YI),分別為93.8%、83.3%、81.1%、94.6%、5.625

14、、0.075和0.771。
　　2.成功構(gòu)建原核表達(dá)載體 pET28a-FimH1-156,經(jīng)對融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化,在IPTG濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)4h后,目的蛋白表達(dá)量最高,主要以包涵體形式存在;WB證實該FimH1-156融合蛋白可與抗6×His單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)。
　　3.融合蛋白模型組的大鼠24小時尿蛋白總量在免疫后第3天開始升高,第7天、35天、50天時顯著高于其對照組(p<0.05);免疫后50天,大鼠血

15、清UREA、CREA、UA水平,均顯著高于其對照組(p<0.05);免疫后35天,腎臟組織顯示局灶壞死,免疫后50天新月體形成,肺泡壁增厚、部分?jǐn)嗔?免疫WKY大鼠35天后,血清IL-17A表達(dá)均顯著高于其對照組(p<0.05); IL-17A與24小時尿蛋白之間存在明確相關(guān)性(R=0.5566,p=0.0210)。多肽模型組的大鼠在13天時24小時尿蛋白定量顯著高于多肽對照組(P<0.05);腎臟損傷無明顯特異性,可見系膜細(xì)胞增生、炎

16、性細(xì)胞浸潤,未見明顯局灶壞死及新月體形成;IL-17A水平表達(dá)也顯著高于多肽對照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1. LAMP-2抗體對AAV所致新月體腎炎具有較好的診斷價值,并在ANCA陰性的新月體腎炎發(fā)現(xiàn)LAMP-2抗體,需進(jìn)一步大樣本驗證。
　　2.成功克隆 FimH1-156融合蛋白表達(dá)基因并構(gòu)建至原核表達(dá)載體,獲得了包涵體純化的FimH1-156融合蛋白,為下一步建立實驗動物腎損傷模型奠定了基礎(chǔ)。