利用分支短肽阻斷IgG-Fcγ受體在ANCA相關(guān)性小血管炎的體外保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性小血管炎(Antineutrophil cytoDlasmicantibodies associated vasculitis，AASV)是一類病情兇險(xiǎn)，易于復(fù)發(fā)，如不及時(shí)治療預(yù)后極差的疾病。目前所廣泛使用的激素和免疫抑制劑聯(lián)合治療策略，雖提高了短期生存率，但嚴(yán)重的副作用使得AASV遠(yuǎn)期預(yù)后不佳。ANCA不僅是AASV重要血清學(xué)標(biāo)志物，而且是AASV的重要致病因素。ANCA IgG與靶細(xì)胞表面FW受體相互作用在

2、ANCA參與AASV發(fā)病中具有關(guān)鍵作用。本研究將以干預(yù)IgG-Fc受體間作用為靶點(diǎn)，采用三肽四倍體分支短肽(tgl9320)，探討其對AASV的體外保護(hù)作用。 (一)ANCA對中性粒細(xì)胞表面Fcγ受體表達(dá)的影響及其臨床意義 提純活動(dòng)期AASV患者ANCA IgG，間接免疫熒光聯(lián)合抗原特異性Elisa鑒定ANCA。新鮮分離健康人中性粒細(xì)胞，以ANCA IgG刺激粒細(xì)胞1小時(shí)，流式細(xì)胞儀結(jié)合共聚焦顯微鏡檢測FcγⅡ／Ⅲ受體

3、的表達(dá)。以35例健康人為對照，流式細(xì)胞儀檢測18例AASV患者粒細(xì)胞FcγⅡ/Ⅲ受體的表達(dá)，比較兩者間的差異。同期進(jìn)行18例從SV患者血管炎活動(dòng)評(píng)分(BVAS)，與粒細(xì)胞FcγⅡ/Ⅲ受體表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANCA IgG與正常人IgG相比可顯著上調(diào)FcγⅡ/Ⅲ受體的表達(dá)(Mnx61.51 vs49.17，P<0.01)，但對FcγⅡ受體表達(dá)無影響(Mnxl5.63vsl4.06，P>0.05)。AASV患者粒細(xì)胞FcγⅢ受體表達(dá)

4、平均熒光強(qiáng)度顯著高于正常人(Mnx61.51 vs53.08，P<0.01)，而FcγⅡ受體表達(dá)與正常人無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。FcγⅢ受體表達(dá)與BVAS顯著正相關(guān)(P<0.01)。提示系統(tǒng)性小血管炎患者存在高表達(dá)的FcγⅢ受體水平，體外ANCA可以調(diào)控FCγⅢ受體的表達(dá)，監(jiān)測FcγⅢ受體的表達(dá)對于判斷疾病活動(dòng)可能具參考價(jià)值。 (二)阻斷IgG-Fcγ受體間作用短肽對中性粒細(xì)胞活化及凋亡的保護(hù)作用 人工合成短肽tgl9320并鑒

5、定其與人IgG的結(jié)合，玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)觀察tgl9320對IgG與Fcγ受體相互作用的阻斷效應(yīng)。以TNF-α(2ng／ml)預(yù)激中性粒細(xì)胞后以ANCA IgG(200ug／ml)誘發(fā)其呼吸爆發(fā)，tgl9320組以2.5mg／ml tgl9320預(yù)處理粒細(xì)胞45分鐘，中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)以Ferri-cytochrome reductionassay法檢測。以tgl9320預(yù)處理經(jīng)TNFα預(yù)激的粒細(xì)胞1.5小時(shí)，ANCA(200ug／ml)

6、刺激粒細(xì)胞后分別在3、6、9、12和18小時(shí)收獲細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡細(xì)胞之Sub-G1峰變化，結(jié)合DNA缺口末端標(biāo)記技術(shù)觀察tgl9320對ANCA促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)tgl9320劑量依賴性與人IgG結(jié)合(P<0.001)，并顯著阻斷IgG與Fcγ受體的相互作用(玫瑰花環(huán)形成率20.3％vs53.2％，P<0.001)。tgl9320顯著抑制ANCA所致中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)(1.83nomels

7、／10<'6>cells VS 12.99nomels／10<'6>cells，P<0.01)。ANCA進(jìn)行性促進(jìn)經(jīng)TNFa預(yù)處理的粒細(xì)胞凋亡(P<0.01)；tgl9320處理組粒細(xì)胞凋亡率在各時(shí)間點(diǎn)均低于ANCA作用組(P<0.01)，而與正常對照組無差異。表明分支短肽tgl9320可干預(yù)ANCA對中性粒細(xì)胞的活化以及凋亡的促進(jìn)，證實(shí)Fc7受體在ANCA促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡過程中具有關(guān)鍵作用。 (三)tgl9320對粒細(xì)胞與

8、內(nèi)皮細(xì)胞間粘附及粘附分子ICAM-1表達(dá)影響及機(jī)制原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，提純活動(dòng)期WG患者ANCA IgG。分別以TNFα，ANCA及ANCA+tgl9320處理HUVEC細(xì)胞18小時(shí)。新鮮分離健康人中性粒細(xì)胞，細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法檢測不同組粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附率。以不同患者ANCA IgG刺激經(jīng)或未經(jīng)TNFα預(yù)刺激的HUVEC，Western-blot檢測細(xì)胞間粘附分子ICAM-1的蛋白表達(dá)。tgl9320預(yù)孵育HUV

9、EC細(xì)胞后，分別以TNFα、正常人IgG、ANCA、ANCA+tgl9320刺激內(nèi)皮細(xì)胞，Western-blot及real-time PCR檢測ICAM-1蛋白和核酸表達(dá)，ELISA檢測上清中sICAM-1的表達(dá)，westem-blot檢測p-IkappaB的表達(dá)。分別以ANCA IgG(500ug/m1)及ANCA+tgl9320(500ug／ml)刺激HUVEC細(xì)胞6小時(shí)，間接免疫熒光檢測NF-kappaB核轉(zhuǎn)位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANCA

10、 IgG能夠顯著上調(diào)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附率(P<0.05)。tgl9320組較ANCA組粘附率顯著降低(P<0.05)，但tgl9320組粘附率仍顯著高于正常對照組(26％VS 9％，P<0.05)。Western-blot結(jié)果表明以不同患者ANCA IgG刺激HUVEC細(xì)胞，均可上調(diào)ICAM-1蛋白表達(dá)，與正常人IgG相比有顯著性差異(P

11、gl9320從mRNA和蛋白表達(dá)及上清分泌的不同水平阻斷ANCA對ICAM-1的作用(P

12、FC受體參與了ANCA促進(jìn)粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的過程，tgl9320通過抑制IkappaB磷酸化進(jìn)而干預(yù)NF-kappaB活化的途徑抑制ANCA對ICAM-1的上調(diào)表達(dá)。 (四)tgl9320對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和遷移能力的影響提純活動(dòng)期WG患者的ANCA IgG，分別以PR3、PR3+ANCA和PR3+ANCA+tgl9320刺激HUVEC細(xì)胞8小時(shí)，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，Hochest熒光染色觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞核的改變。Boyden

13、小室法細(xì)胞定量遷移試劑盒檢測tgl9320對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以PR3刺激HUVEC細(xì)胞8小時(shí)，可顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡(P0.05)。提示在ANCA增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中，與內(nèi)皮細(xì)胞表面Fc7受體的結(jié)