DADS活化HL-60細胞G-,2--M檢查點與cyclinB1亞細胞分布和p21的關(guān)系.pdf

1、研究背景DADS是從大蒜中分離出的脂溶性單體有機硫化合物，可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和細胞周期停滯等方式抑制多種腫瘤細胞的生長。前期的研究顯示：DADS能誘導HL-60細胞生長阻滯在G2/M期，但機制尚不完全清楚。cyclinB1是細胞周期G2/M期的特異性周期素，是唯一隨細胞周期變化而發(fā)生亞細胞分布改變的細胞周期素，cyclinB1的核轉(zhuǎn)位是啟動細胞有絲分裂的必要條件。p21是細胞周期蛋白依賴性激酶(cycledependent

2、kinase，CDK)抑制劑，可與CDK、cyclinB1和增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)形成四元復合物，在細胞周期推進過程中發(fā)揮重要作用。研究表明：p21與cyclinB1誘導細胞G2/M期生長阻滯可能涉及如下兩種機制：形成p21-PCNA-cdc2/cyclinB1四元復合物競爭性抑制cdc25與PCAN結(jié)合，阻斷cdc25催化cdc2去磷酸化；這種四元復合物阻斷cdc2活

3、化激酶(cdc2activatingkinase，CAK)磷酸化cdc2，以上兩種機制協(xié)同抑制cdc2激酶的活化，誘導細胞G2/M期生長阻滯。但是迄今為止，cyclinB1亞細胞分布和p21在DADS誘導腫瘤細胞G2/M期生長阻滯中的作用尚未得到證實。方法用20μMDADS處理HL-60細胞，MTT法測定DADS對HL-60細胞增殖活性的影響，流式細胞術(shù)測定DADS對細胞增殖周期的影響，Westernblot測定DADS對cyclinB

4、1亞細胞分布、p21與c-myc的表達水平的影響，免疫共沉淀分析cyclinB1與p21兩者相互作用，重組質(zhì)粒pcDNA3-c-myc和對照空質(zhì)粒pcDNA3分別轉(zhuǎn)染HL-60細胞，用流式細胞術(shù)、Westernblot以及丫啶橙染色法檢測p21受到抑制后，DADS對細胞增殖周期和細胞命運的影響。結(jié)果為了探討DADS對HL-60細胞增殖的影響，經(jīng)20μMDADS、DMSO、及10nM全反式維甲酸(ATRA)孵育HL-60細胞24h，結(jié)果顯

5、示：DADS能抑制HL-60細胞增殖，20μMDADS對細胞增殖的抑制率與ATRA(10nM)對細胞的抑制率接近。為了確定DADS阻滯HL-60細胞周期時相，用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布，結(jié)果顯示：DADS處理HL-60細胞12h，G2/M期細胞百分數(shù)平均值上升到最大值(37.6％)。提示：DADS能抑制HL-60細胞增殖并活化細胞增殖周期G2/M期檢測點?！　dc2/cyclinB1是細胞進入有絲分裂的始動因素，且cyclinB1

6、核轉(zhuǎn)位是細胞啟動有絲分裂必要條件，為了探討cyclinB1的亞細胞分布與DADS誘導細胞G2/M期生長阻滯的關(guān)系，用20μMDADS處理HL-60細胞。結(jié)果顯示：cyclinB1表達逐漸增強，DADS處理HL-60細胞12h，細胞質(zhì)cyclinB1表達達到高峰，而此時細胞核cyclinB1表達明顯受到抑制。提示：cyclinB1胞質(zhì)定位與DADS誘導HL-60細胞G2/M期檢查點有關(guān)?！　榱颂接憄21在DADS啟動G2/M期檢查點中

7、的作用，20μMDADS處理HL-60細胞0h～24h。結(jié)果顯示：DADS能誘導HL-60細胞p21表達，至12h時達高峰。為了解p21與cyclinB1的存在狀態(tài)及相互作用，用抗cyclinB1抗體沉淀DADS處理12h的HL-60細胞總蛋白，經(jīng)ProteinA/GPLUS-Agarose處理，用抗p21單克隆抗體作為檢測抗體，進行蛋白質(zhì)免疫印跡。結(jié)果顯示：cyclinB1能被p21抗體沉淀，p21與cyclinB1以復合物的形式存在

8、，p21通過與cyclinB1結(jié)合，發(fā)揮其生物學效應。這些結(jié)果提示：p21可能與DADS啟動HL-60細胞G2/M期檢查點有關(guān)?！　榱诉M一步證實p21在DADS活化HL-60細胞G2/M檢查點中的作用，將pcDNA3-c-myc和pcDNA3分別轉(zhuǎn)染HL-60細胞，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染c-myc質(zhì)粒的HL-60細胞能穩(wěn)定表達c-Myc，此時轉(zhuǎn)染c-myc質(zhì)粒的HL-60細胞p21表達降低。提示：c-Myc能夠抑制DADS誘導HL-60細胞

9、p21表達。為了探討c-Myc下調(diào)p21的表達對DADS啟動HL-60細胞G2/M期檢查點的作用，用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布。結(jié)果顯示：DADS處理上述細胞12h后，c-myc轉(zhuǎn)染的HL-60細胞G2/M期細胞百分數(shù)下降到22.7％，而空質(zhì)粒pcDNA轉(zhuǎn)染的HL-60細胞G2/期細胞百分數(shù)為37.6％，并且，未加DADS處理HL-60細胞G2/M期細胞百分數(shù)為20.3％。這些結(jié)果提示：當c-Myc內(nèi)源性表達上調(diào)抑制HL-60細胞p21

10、的表達時，能逆轉(zhuǎn)DADS誘導的HL-60細胞的G2/M期阻滯?！　榱诉M一步確定c-Myc下調(diào)p21的表達對HL-60細胞命運的影響，采用丫啶橙染色觀察HL-60細胞凋亡形態(tài)。結(jié)果顯示：DADS處理c-myc轉(zhuǎn)染12h的HL-60細胞呈現(xiàn)明顯凋亡特征：細胞膜以及核膜保持完整，細胞核濃縮。上述結(jié)果提示：當c-Myc內(nèi)源性表達上調(diào)抑制p21表達時，DADS能夠誘導HL-60細胞凋亡。結(jié)論1.DADS活化HL-60細胞G2/M期檢查點與cy