HSP90抑制劑17-DMAG在肺動(dòng)脈高壓中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓（Pulmonary artery hypertension,PAH）是一類以肺小動(dòng)脈收縮、肺血管增殖與重構(gòu)為主要特征，由此引起肺血管阻力進(jìn)行性升高，最終導(dǎo)致右心功能衰竭的肺血管疾病。肺動(dòng)脈高壓屬于肺高壓的第1類，其右心導(dǎo)管檢查符合，靜息狀態(tài)下平均肺動(dòng)脈壓升高（≥25mmHg），且肺毛細(xì)血管楔壓正常（≤15mmHg）。
　　肺動(dòng)脈高壓患者發(fā)病年齡輕、病情進(jìn)展快、生活質(zhì)量差、死亡率高，未經(jīng)特異性靶向治療的特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患

2、者每年將以15％的速率死亡，中位生存時(shí)間僅為2.8年，故被稱為“惡性心血管病”。在過去二十余年，前列環(huán)素類藥物等特異性的靶向治療藥物、基因干細(xì)胞治療、去肺交感神經(jīng)方法等新技術(shù)、新療法的應(yīng)用給肺動(dòng)脈高壓患者帶來了新的希望，但迄今為止仍缺乏確切有效的根治方法。
　　熱休克蛋白（Heat shock protein,HSP）是上個(gè)世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)，并確認(rèn)了其生物學(xué)功能。HSP90是其中的一種亞型，在應(yīng)激狀態(tài)下，HSP90產(chǎn)物急劇增加，輔助蛋白

3、質(zhì)重折疊，這有助于損傷的細(xì)胞恢復(fù)正常功能，提高機(jī)體生存能力。HSP90的結(jié)合底物主要是信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的蛋白激酶和一些突變蛋白質(zhì)，如Raf蛋白激酶、蛋白激酶B、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子等，這些信號(hào)傳導(dǎo)分子的激活和過表達(dá)對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起著重要的作用。HSP90抑制劑可以拮抗HSP90與效應(yīng)蛋白的結(jié)合，從而阻斷多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，因此，被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療。從病理過程來看，肺動(dòng)脈高壓的肺血管細(xì)胞增殖與腫瘤細(xì)胞類似，均表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖過度和凋亡抑

4、制。那么，HSP90及其效應(yīng)蛋白是否參與了肺動(dòng)脈高壓的血管增殖和重構(gòu)過程？在肺動(dòng)脈高壓的肺血管增殖調(diào)控過程中，HSP90是起促進(jìn)作用還是抑制作用？HSP90抑制劑能否用于肺動(dòng)脈高壓的治療？迄今為止，國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于HSP90與肺動(dòng)脈高壓關(guān)系的研究，亦無HSP90抑制劑用于肺動(dòng)脈高壓的報(bào)導(dǎo)。
　　鑒于以上設(shè)想，本課題將評(píng)價(jià)HSP90在肺動(dòng)脈高壓患者中的表達(dá)和作用。建立野百合堿藥物誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓大鼠外周血HSP

5、90的含量及肺組織HSP90的mRNA和蛋白的表達(dá)。采用HSP90抑制劑17-二甲氨基-17-去氧甲基格爾德霉素（17-DMAG）干預(yù)肺動(dòng)脈高壓大鼠，評(píng)價(jià)17-DMAG在肺動(dòng)脈高壓治療中的安全性和有效性。在細(xì)胞學(xué)上，通過評(píng)價(jià)HSP90抑制劑對(duì)平滑肌細(xì)胞的作用，探討HSP90抑制劑治療肺動(dòng)脈高壓的可能作用機(jī)制，為肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)以及新的治療思路。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 肺動(dòng)脈高

6、壓患者HSP90的表達(dá)
　　目的：評(píng)價(jià)HSP90在肺動(dòng)脈高壓患者外周血的含量，及與肺動(dòng)脈高壓病情的關(guān)系。
　　方法：1、統(tǒng)計(jì)入選患者的一般情況。2、入選患者擇期行右心導(dǎo)管檢查，根據(jù)肺動(dòng)脈壓力，將患者分為肺動(dòng)脈高壓組和正常對(duì)照組，剔除臨界肺動(dòng)脈高壓患者。3、用ELISA檢測(cè)患者外周血HSP90含量。
　　結(jié)果：1、兩組人群在年齡、身高、體重、收縮壓、舒張壓、心率和左室射血分?jǐn)?shù)等參數(shù)均無明顯差異（P>0.05），肺動(dòng)脈高壓

7、患者中女性比例明顯升高，男女比為1:2。2、肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈收縮壓、舒張壓和平均肺動(dòng)脈壓均明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。3、與對(duì)照組相比，肺動(dòng)脈高壓患者外周血的HSP90含量明顯高于對(duì)照組（10.12±7.20ng/mLvs6.11±2.84ng/mL,P<0.05）。
　　結(jié)論：肺動(dòng)脈高壓患者外周血HSP90含量升高，且與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。
　　第二部分 肺動(dòng)脈高壓大鼠模型HSP90的表達(dá)
　

8、　目的：建立肺動(dòng)脈高壓大鼠動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)HSP90在肺動(dòng)脈高壓大鼠的表達(dá)及作用。
　　方法：1、SD雄性大鼠頸背部皮下注射野百合堿50mg/kg。2、建模3周后大鼠行右心導(dǎo)管檢查，測(cè)量右室壓和肺動(dòng)脈壓。3、大鼠從眼眶或頸動(dòng)脈取外周血，檢測(cè)肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、高敏C反應(yīng)蛋白和血沉等。4、觀察大鼠心、肺、肝、腎組織，并作HE染色病理切片，觀察其病變情況，比較肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比、中膜面積百分比及右心室肥厚指數(shù)RV/

9、(LV+IVS)。
　　結(jié)果：1、模型組大鼠右室收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓均明顯高于正常對(duì)照組大鼠（P<0.01），且模型組大鼠平均肺動(dòng)脈壓均大于25mmHg，提示了野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠建模成功。2、兩組大鼠在外周血肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均無明顯差異（P>0.05），但肺動(dòng)脈高壓大鼠的血沉與高敏C反應(yīng)蛋白明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。3、病理切片HE染色顯示肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌增生、管腔狹窄，心肌肥厚、纖維

10、化，肝臟、腎臟明顯淤血。模型組大鼠肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比、中膜面積百分比及右心室肥厚指數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組大鼠（P<0.01）。
　　結(jié)論：成功建立了肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，外周血和肺組織中HSP90表達(dá)升高，與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。
　　第三部分 HSP90抑制劑17-DMAG對(duì)肺動(dòng)脈高壓的治療作用
　　目的：評(píng)價(jià)HSP90抑制劑17-DMAG治療肺動(dòng)脈高壓大鼠的安全性和有效性。
　　方法：1、按照第

11、二部分方法建立肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，肺動(dòng)脈高壓大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、法舒地爾治療組（15mg/kg.d）、低劑量17-DMAG（5mg/kg.2d）治療組和高劑量17-DMAG（10mg/kg.2d）治療組。2、ELISA法檢測(cè)大鼠外周血中HSP90的濃度，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)肺組織中HSP90基因的表達(dá)。3、比較各組大鼠生存率。4、從眼眶或頸動(dòng)脈取血，檢測(cè)白細(xì)胞、血漿總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及肌酐等生化指標(biāo)，評(píng)價(jià)17-D

12、MAG的安全性。
　　結(jié)果：1、低劑量17-DMAG組和高劑量17-DMAG組大鼠外周血HSP90含量較對(duì)照組明顯降低，但肺組織中HSP90基因的表達(dá)無明顯變化。2、治療20天后，對(duì)照組、法舒地爾組、17-DMAG低劑量組和高劑量組大鼠的生存率分別為44.4%、77.8%、66.7%和30.0%。3、右心導(dǎo)管檢查顯示，17-DMAG治療組大鼠的右室收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓較對(duì)照組明顯降低（P<0.05），但法舒地爾組、高劑量17-DM

13、AG組、低劑量17-DMAG組之間，右室收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓無明顯差異（P>0.05）。4、外周血檢查顯示，與對(duì)照組相比，17-DMAG組大鼠白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及血漿總膽紅素?zé)o明顯差異（P>0.05），肌酐有上升的趨勢(shì)，但無顯著差異（P>0.05）；與對(duì)照組和法舒地爾組相比，17-DMAG組大鼠血漿谷丙轉(zhuǎn)移酶、谷草轉(zhuǎn)移酶也明顯升高（P<0.05），而且高劑量17-DMAG組也比低劑量17-DMAG組明顯升高（P<0.05）。
　　

14、結(jié)論：HSP90抑制劑17-DMAG對(duì)肺動(dòng)脈高壓有一定的治療效果，可能是通過緩解肺血管增殖與重構(gòu)實(shí)現(xiàn)的，但該藥存在一定的安全性隱患。
　　第四部分 17-DMAG調(diào)控平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制
　　目的：探索HSP90抑制劑17-DMAG對(duì)肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)的作用機(jī)制。
　　方法：1、常規(guī)方法培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，利用不同濃度17-DMAG（0、50、200、500、1000nmol/L）處理，確定最佳的作用濃度。2、利用

15、MTT法，CCK8法確定17-DMAG對(duì)平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響。3、利用BrdU免疫熒光檢測(cè)17-DMAG對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：1、不同濃度的17-DMAG處理平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)活力檢測(cè)顯示1000nmol/L的17-DMAG對(duì)VSMC的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用（P<0.01），細(xì)胞數(shù)目為對(duì)照組的78.4%，并且這種抑制效果具有時(shí)間和劑量依賴性。2、1000nmol/L的17-DMAG處理平滑肌細(xì)胞24h后，與對(duì)

16、照組相比，細(xì)胞增殖水平明顯降低（P<0.01）。3、與對(duì)照組相比，17-DMAG處理的平滑肌細(xì)胞凋亡水平無明顯變化（P>0.05）。4、1000nmol/L的17-DMAG處理的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在細(xì)胞周期G1期。5、與對(duì)照組相比，17-DMAG處理的平滑肌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白D的表達(dá)明顯降低（P<0.01），而細(xì)胞周期蛋白E的表達(dá)無明顯變化（P>0.05）。
　　結(jié)論：HSP90抑制劑17-DMAG影響細(xì)胞周期蛋白

17、的表達(dá)，使平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在細(xì)胞周期G1期，從而抑制平滑肌細(xì)胞增殖，對(duì)肺動(dòng)脈高壓發(fā)病過程中的血管重構(gòu)可能具有抑制作用。
　　總結(jié)：在肺動(dòng)脈高壓患者中，外周血HSP90含量明顯增高，并且與腦鈉肽前體和白介素6的含量成正相關(guān)；在肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，外周血和肺組織HSP90表達(dá)也明顯增加，這提示HSP90含量的升高與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。HSP90抑制劑17-DMAG能有效的降低肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈壓力，減輕肺血管增殖、