重組pAd-CMV-V5-DEST-p16載體的構(gòu)建及其對人肝癌細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、目的：構(gòu)建pad／CMV／V5一DEST—p16重組腺病毒載體，并觀察野生型p16基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞SMMC7721株的抑制作用。 方法：用載體間的DNA相互靈活轉(zhuǎn)換的多功能系統(tǒng)，即通路克隆系統(tǒng)(gatewaycloningsystem)[1]，構(gòu)建重組p16腺病毒載體。合成上游含salI、kozak序列[2,3、人p16一INK4表達(dá)基因、下游含EcolRI，導(dǎo)入洲D(zhuǎn)18一Tsimple質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM100，測序證實(shí)

2、質(zhì)粒含有目的基因。用salI、EcolRI雙酶切pMD18一Tsimple—p16和pENTR1A質(zhì)粒，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM1.00中，構(gòu)建pENTR1A—p16質(zhì)粒。在通路克隆系統(tǒng)的LR克隆酶催化作用下，通過LR反應(yīng)，入口克隆pENTR1A—p16質(zhì)粒的外源性合成的修飾后的p16cDNA，取代目的載體pAdCMV／V5-DEST中的ccdB基因，形成表達(dá)克隆一p16重組腺病毒質(zhì)粒即pad／CMV／V5一DEST

3、-p16。轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，測序證實(shí)質(zhì)粒含有目的基因。PacI酶切后的重組腺病毒質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體2000介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，產(chǎn)生缺陷性的重組腺病毒。Westernblot分析顯示在由重組腺病毒介導(dǎo)的野生型p16基因在肝癌細(xì)胞SMMC7721中能夠表達(dá)蛋白，被感染的細(xì)胞的生長受抑制。結(jié)果：構(gòu)建了重組p16腺病毒載體，產(chǎn)生缺陷性的重組腺病毒，野生型p16基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞SMMC7721株有抑制作用。 結(jié)論：用通路克隆系