HPV16 E6-shRNA慢病毒的構建及其對宮頸癌細胞抑制作用研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirusHPV)的感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，其中50％以上是HPV16型。HPV的E6和E7基因整合到宮頸上皮細胞并持續(xù)表達是引發(fā)宮頸癌的主要原因，同時也是維持宮頸癌惡性表型的必要條件。目前阻斷細胞內整合型E6的表達主要使用反義核酸和靶向性核酶技術，但這兩種方法的抑制效率不高。因此尋找更有效阻斷的方法，對探索E6致癌及維持宮頸癌惡性表型的下游機制具有重要的意義。 由于傳統(tǒng)方法在晚期宮

2、頸癌的療效有限，近年來宮頸癌生物治療的研究顯示了很誘人的應用前景。由于宮頸癌細胞中整合的HPV致癌基因與人體自身基因無同源性，因而成為理想的生物治療靶標。 RNA干擾技術是通過雙鏈RNA來阻斷目的基因的表達，使用經細胞內轉錄后形成的發(fā)夾狀短鏈干擾RNA(smallhairpinRNA，shRNA)，抑制靶基因的持續(xù)時間可達7天以上，同時很便于進行實驗動物的體內研究。慢病毒的感染效率高、激發(fā)免疫反應的作用弱，是攜帶干擾RNA理想載

3、體。 目前以慢病毒為載體的shRNA抑制宮頸癌細胞中E6的表達尚未見文獻報道，因此我們設計了三條靶向HPV16E6的shRNA表達序列，將其克隆到慢病毒工作質粒PLL3.7中并經酶切和測序鑒定。PLL3.7與三種混合包裝質粒以lipofectamine2000包裹后轉染293FT細胞，由此產生shRNA重組慢病毒。以慢病毒感染宮頸癌Caski細胞后，檢測癌細胞中HPV16E6表達的變化，與E6致癌相關基因P21和P53表達的變化

4、；觀察細胞增殖能力和侵襲能力的變化。分別將shRNA處理的Caski細胞和對照Caski細胞種植于裸鼠皮下，觀察兩組細胞的成瘤能力。以Caski細胞種植于裸鼠皮下，待腫瘤形成后注射shRNA重組慢病毒，觀察移植瘤的生長抑制情況；E6、P53和P21蛋白表達的變化。研究結果如下。 1.293FT細胞包裝出的慢病毒滴度為5×106TU/ml，濃縮后其滴度可達108TU/ml，其感染Caski細胞的最佳MIO為2.5。 2.慢

5、病毒感染后，Caski細胞中HPV16E6mRNA的含量下降80％，E6蛋白的表達下降75％；同時細胞中P53和P21蛋白表達水平明顯上升，約為對照組的2.5倍；shRNA作用一個月后，細胞中E6的表達水平仍為對照組的35％。 3.shRNA作用于Caski細胞7天后，細胞增殖能力下降，實驗組僅為對照組細胞數的45％；細胞侵襲力下降，實驗組穿膜細胞比對照組減少65％。 4.shRNA作用后的Caski在裸鼠皮下未能長出腫

6、瘤。 5.shRNA重組慢病毒注射后，裸鼠皮下腫瘤明顯縮小，其重量約為對照組的20％；腫瘤細胞中E6蛋白的表達下降，P53和P21蛋白的表達水平上升。 病毒感染增殖活躍的細胞，其最佳MIO多為1.0左右；由于受包裝系統(tǒng)效率的限制，一般逆轉錄病毒原液的滴度只有105TU/ml。本實驗發(fā)現：慢病毒原液的滴度在106TU/ml以上；其感染宮頸癌Caski細胞的最佳MIO為2.5；無義慢病毒感染前后Caski細胞的形態(tài)和增殖能力

7、無明顯變化。這提示：增加慢病毒用量對宮頸癌Caski細胞無明顯毒性，卻能顯著提高靶細胞的感染率；慢病毒原液滴度高，濃縮后更可提升100倍以上，具有良好的實用性，是將目標基因導入宮頸癌細胞較理想的載體。 HPVE6蛋白結合P53并通過泛素途徑使其降解是細胞惡性轉化的關鍵步驟之一。處于穩(wěn)定期的細胞DNA受到損傷時，P53數量的增加使細胞停止于G1期，使損傷的DNA在復制之前得以修復。P53能激活WAF基因，WAF基因產物P21可與C

8、dk家族的激酶結合并抑制其活性，使細胞周期停止。P53失活后對細胞增殖周期相關因子P21、PCNA、Cyclins、Cdks的調節(jié)作用喪失，細胞中DNA損傷積累造成細胞癌變。我們的研究表明：慢病毒感染Caski細胞后，能將shRNA表達序列整合到細胞基因組中，轉錄形成的shRNA能阻斷HPV16E6的表達，蛋白抑制率在65％以上；在HPV16E6表達下降后，其對P53的抑制作用被解除，細胞中P53蛋白的含量升高，P21蛋白的表達也升高。

9、這提示：我們構建的shRNA重組慢病毒能高效地抑制癌細胞內HPV16E6的表達，持續(xù)時間可達1月以上；這為深入研究E6致癌的下游信號轉導提供了良好的工具。 HPVE6蛋白的持續(xù)表達是宮頸癌細胞維持惡性表型的關鍵因素之一。我們在細胞水平的研究表明，抑制E6蛋白的表達后細胞增殖能力和侵襲能力都大幅下降；進一步通過動物實驗證實，抑制E6蛋白的表達后，Caski細胞失去成瘤能力。在宮頸癌動物模型體內注射重組慢病毒后，shRNA被成功地帶

10、入癌細胞內，E6蛋白的表達下降，P53和P21蛋白表達升高；同時腫瘤的體積縮小。這提示：慢病毒注射后，在體內保持了很高的活性，對腫瘤細胞有良好的感染效率；攜帶shRNA的慢病毒在宮頸癌治療方面極具應用前景。 綜上所述，本課題成功構建了能高效抑制細胞中整合型E6表達的shRNA重組慢病毒，為進一步研究E6致癌的下游機制提供了良好的工具。通過細胞水平研究證實了shRNA對宮頸癌細胞惡性表型的抑制作用；初步闡明了在動物模型中以慢病毒攜