內(nèi)皮微顆粒與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分腫瘤壞死因子-α[促進(jìn)CD62E+、CD31+內(nèi)皮微顆粒的釋放及其機(jī)制
　　 目的：采用不同濃度的腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）體外刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察INF-α所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其培養(yǎng)上清中CD62E+、CD31+內(nèi)皮微顆粒釋放水平，并初步探討內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的活性氧（Reactive oxygenspecies，ROS）在內(nèi)皮微顆粒形成中的可能機(jī)制。
　　 方法

2、：倒置光學(xué)顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡下觀察不同濃度INF-α作用于內(nèi)皮細(xì)胞24h后，細(xì)胞形態(tài)和核的改變；流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)上清中CD62E+、CD31+EMPs的釋放水平；熒光探針DCFH-DA法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成情況。
　　 結(jié)果：TNF-α可致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核改變；隨著TNF-α刺激濃度的增加，其培養(yǎng)上清中，CD62E+EMPs釋放水平越明顯，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P<0.01）；上清中CD31+EMPs釋

3、放水平也明顯增高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對(duì)照組相比，CD62E+/CD31+EMPs二者比值明顯增大（P<0.01）；隨著TNF-α刺激濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平升高越明顯，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：不同濃度的TNF-α致?lián)p內(nèi)皮細(xì)胞的程度不同，隨著TNF-α刺激濃度的增加，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度更明顯，CD62E+EMPs和CD31+EMPs釋放量也相應(yīng)增加，尤以C

4、D62E+EMPs增加為甚，推測(cè)CD62E+EMPs釋放水平可用來預(yù)測(cè)內(nèi)皮損傷程度；推測(cè)ROS途徑可能參與了內(nèi)皮微顆粒形成與釋放的過程。
　　 第二部分外源性CD62E+內(nèi)皮微顆粒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 目的：觀察外源性CD62E+EMPs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞生長(zhǎng)周期及凋亡的影響，探討CD62E+EMPs與內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度的相關(guān)性。
　　 方法：掃描電鏡下觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞膜表面微顆粒釋放情況；

5、CD62E+EMPs的檢測(cè)：以100ng/ml TNF-α[刺激呈單層細(xì)胞生長(zhǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心并去除細(xì)胞碎片，再收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，以20500g超速，4℃離心2h，棄上清液，用含2％FBS的培養(yǎng)液懸浮微顆粒，流式細(xì)胞儀檢測(cè)懸液中CD62E+EMPs的濃度，并于2h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)；CCK-8法檢測(cè)外源性CD62E+EMPs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響；FCM PI單染法檢測(cè)外源性CD62E+EMPs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)周

6、期的影響；PI/Annexin V+雙染法檢測(cè)外源性CD62E+EMPs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：經(jīng)掃描電鏡觀察TNF-α[所刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，可見膜表面分泌的直徑約1.0μm小囊泡，證實(shí)了膜表面內(nèi)皮微顆粒的釋放；流式細(xì)胞儀檢測(cè)到經(jīng)超速離心后收集的懸液中CD62E+EMPs的濃度約為4x107/ml；經(jīng)105/ml、106/ml、107/mlCD62E+EMPs作用內(nèi)皮細(xì)胞24h后，可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，細(xì)胞增

7、殖抑制率分別為19.1±2.2％、34.2±3.7％和45.7±4.2％，105/ml、106/ml、107/ml濃度組與104/ml濃度組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；經(jīng)104/ml、105/ml、106/ml、107/mlCD62E+EMPs刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h后，G0/G1期比例分別為50±2.8％、59.8±2.3％、66.1±2.2％和73.3±3.1％，105/ml、106/ml、107/ml濃度組與104/ml濃度

8、組和正常細(xì)胞對(duì)照組（48士3％）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PI/AnnexinV+雙染法FCM證實(shí)104/ml、105/ml、106/ml、107/ml CD62E+EMPs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞24h后，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡效應(yīng)，其凋亡率分別為3±0.6％、6.32±1.2％、9.2±1.3％和11.4±1.2％，105/ml、106/ml、107/ml濃度組與104/ml濃度組和對(duì)照組（1.5±0.5％）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：外源性CD62E+EMPs可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡效應(yīng)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有直接損傷作用。
　　 第三部分辛伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞微顆粒釋放的影響及其機(jī)制的研究
　　 目的：研究辛伐他汀對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞微顆粒釋放的影響及其機(jī)制，探討在內(nèi)皮保護(hù)劑作用下，內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮微顆粒的情況。
　　 方法：用10ng/mlTNF-α作用

10、于內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)不同濃度的辛伐他汀保護(hù)劑作用后，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察Hochest單染的內(nèi)皮細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化；用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中CD62E+、CD31+EMPs的釋放水平；用熒光探針DCFH-DA法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成情況；
　　 結(jié)果：10ng/ml TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，可引起細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng)及細(xì)胞間隙增大以及細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)改變，經(jīng)0.1、1、5μmol/L辛

11、伐他汀干預(yù)后，未見細(xì)胞形態(tài)改變；其細(xì)胞培養(yǎng)上清中CD62E+EMPs釋放量水平分別為1.654±0.18、1.25±0.09、1.02±0.2x106/ml，能明顯抑制CD62E+EMPs的釋放，與未經(jīng)辛伐他汀保護(hù)的單純TNF-α處理組（2.56±0.16×106/ml）相比，有顯著性差異（P<0.01）。經(jīng)0.1、1、5μmol/L辛伐他汀干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的CD31+EMPs的量分別為20.64±219.44±1.418.84±2

12、×103/ml，與未經(jīng)辛伐他汀保護(hù)的單純FNF-α處理組（21.1±2.5×103/m1）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；經(jīng)0.1、1、51μmol/L辛伐他汀干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平分別為對(duì)照組的151±12％、1224±10％、1084±10％，與未經(jīng)辛伐他汀保護(hù)的單純TNF-α處理組（2054±21％）相比，有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：內(nèi)皮保護(hù)劑辛伐他汀可以顯著降低TNF-a誘導(dǎo)