CXCL16-ox-LDL在阿霉素腎病小鼠中的動(dòng)態(tài)變化及辛伐他汀干預(yù)作用的研究.pdf

1、研究背景與研究目的:
　　微小病變型腎病綜合征(Minimalchangednephroticsyndrome，MCNS)是兒童原發(fā)性腎病綜合征中最常見的病理類型。高脂血癥是兒童原發(fā)性腎病綜合征一項(xiàng)重要的病理生理改變，以血漿總膽固醇(Cho)和低密度脂蛋白(LDL)升高為突出表現(xiàn)。大量的研究結(jié)果表明，高脂血癥和脂質(zhì)在腎臟沉積是發(fā)生腎小球硬化的重要危險(xiǎn)因素[1-3]。然而，目前有關(guān)脂質(zhì)在腎臟沉積，腎臟細(xì)胞發(fā)生泡沫樣改變，從而導(dǎo)致腎損

2、害的機(jī)制尚不完全明了。
　　CXCL16是2000年發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化損傷部位巨噬細(xì)胞中的一種趨化因子和膜結(jié)合蛋白，它以跨膜結(jié)合型存在時(shí)，與氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)結(jié)合，介導(dǎo)脂質(zhì)內(nèi)吞，可能參與了巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成;它以分泌型存在時(shí)，具有趨化因子功能，在免疫系統(tǒng)起重要作用[4-9]。ADAM10是這兩種形式轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。CXCL16通過與其唯一受體CXCR6結(jié)合而發(fā)揮作用。既往研究顯示，在狼瘡性腎炎及急性腎小管壞死

3、患者的尿中CXCL16水平升高，提示CXCL16可能是診斷這些腎臟疾病的標(biāo)志物[10，11]。有關(guān)CXCL16是否與腎病綜合征尤其是微小病變型腎病綜合征和局灶節(jié)段腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，國內(nèi)外尚未報(bào)道。
　　跨膜CXCL16的重要作用是ox-LDL的清道夫受體。GutweinP[12]等體外研究證實(shí)在用于擾素-γ(IFN-γ)刺激人足細(xì)胞，在加或不加金屬蛋白酶抑制劑的條件下，ox-LDL的攝取均增加，應(yīng)用阻斷CXCL16的特異性

4、抗體，人足細(xì)胞ox-LDL的吸收顯著減少，從而提示CXCL16具有對(duì)足細(xì)胞oxLDL清道夫受體的重要作用。有關(guān)CXCL16在腎病綜合征中與脂質(zhì)沉積的關(guān)系，尤其是與ox-LDL的關(guān)系以及CXCL16是否作為ox-LDL的清道夫受體介導(dǎo)其引起腎組織損害國內(nèi)外罕見報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)單純型腎病綜合征忠兒活動(dòng)期血清CXCL16和ox-LDL水平均高于緩解期和正常對(duì)照組，提示血清CXCL16與單純型PNS疾病的活動(dòng)性有關(guān)[12]。
　

5、　他汀類藥物，即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶—HMG-CoA還原酶活性，阻斷細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸代謝途徑，減少膽固醇合成，從而降低血漿膽固醇水平。辛伐他汀是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，是最有效的，應(yīng)用最為廣泛的一種他汀類藥。他汀類藥物不僅有依賴降血脂的腎臟保護(hù)作用，而且還有抗細(xì)胞增殖、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)等非依賴降血脂的腎臟保護(hù)作用，

6、但確切機(jī)制尚不明確[13、14]，其是否通過影響腎組織中CXCL16表達(dá)，從而干擾ox-LDL的細(xì)胞內(nèi)攝取，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，國內(nèi)外均未見報(bào)道。
　　阿霉素誘導(dǎo)的小鼠腎病模型與人類的微小病變及局灶節(jié)段性腎小球硬化極其相似[15-19]。本研究擬通過建立阿霉素腎病小鼠模型，并給以辛伐他汀加以干預(yù)性治療，觀察不同時(shí)間點(diǎn)血、尿、腎組織中CXCL16和ox-LDL的變化及其與腎組織病理損傷程度的關(guān)系，探討CXCL16和ox-LDL與阿霉素

7、腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及辛伐他汀對(duì)阿霉素腎病小鼠腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　研究方法
　　將75只健康雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為建模組(n=50)、對(duì)照組(n=25)。建模組予以一次性尾靜脈注射阿霉素10.5mg/kg建模，對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射同樣劑量的生理鹽水。1周后處死小鼠，出現(xiàn)大量蛋白尿（24h尿蛋白定量≥50mg/kg）者為阿霉素腎病小鼠，將造模成功的44只小鼠隨機(jī)分為單純模型組(n=22)與辛伐他汀治療組(n=22

8、)。治療組于造模一周后每日給予灌喂辛伐他汀20mg/kg。分別于實(shí)驗(yàn)0、1、3、5、7周末用代謝籠收集24h尿，CBB法測(cè)24h尿蛋白定量;全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白(ALB)、膽固醇(Cho)并每組處死5只小鼠;采用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)血清CXCL16、ox-LDL、IFN-γ及尿液CXCL16;采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)腎組織CXCL16、CXCR6、ADAM10及ox-LDL表達(dá);用10％甲醛固定腎組織，常規(guī)石蠟包

9、埋、切片、PAS染色觀察腎臟組織學(xué)改變，同時(shí)腎組織用2.5％戌二醛固定作電鏡檢測(cè)。
　　結(jié)果
　　1.血清及尿液生化指標(biāo)的變化模型組與治療組小鼠于注射阿霉素后1周末出現(xiàn)蛋白尿;與對(duì)照組相比，模型組與治療組小鼠1周末出現(xiàn)血清白蛋白降低（P＜0.05）、膽固醇升高（P＜0.05）、24h尿蛋白定量升高(P＜0.01);與模型組相比，治療組上述指標(biāo)改變皆較輕（P＜0.05）。以上結(jié)果持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　2.血清、尿液CXC

10、L16及血清ox-LDL、IFN-γ的變化與對(duì)照組相比，模型組血清及尿液CXCL16、血清oxLDL、IFN-γ水平明顯增高（P＜0.01），且隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，各組間均有明顯差異(P＜0.01);與模型組相比，治療組上述指標(biāo)改變皆較輕（P＜0.01）。
　　3.光鏡下觀察結(jié)果與同期對(duì)照組相比，模型組小鼠腎組織光鏡下可見腎小球系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多、球囊粘連及局灶節(jié)段硬化，腎小管腫脹、空泡變形，慢性指數(shù)評(píng)分隨時(shí)間的推移逐漸

11、增加(P＜0.01)。治療組小鼠腎組織亦有上述改變，但較同期模型組輕;慢性指數(shù)較同期模型組小(P＜0.01)。
　　4.電鏡下觀察結(jié)果與對(duì)照組比較，電鏡下可見足突融合、系膜基質(zhì)增多、基底膜增厚，治療組病變較輕，而對(duì)照組無明顯變化。
　　5.腎組織CXCL16和ox-LDL、CXCR6、ADAM10的表達(dá)對(duì)照組小鼠腎組織中無或僅有極少量CXCL16、CXCR6、ADAM10、ox-LDL表達(dá)，模型組腎組織中腎小球CXCL16、

12、CXCR6、ADAM10、ox-LDL表達(dá)較對(duì)照組增多(P＜0.01)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)。治療組小鼠上述指標(biāo)較同期對(duì)照組增多(P＜0.01)，較同期模型組少(P＜0.01)。
　　6.各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析相關(guān)分析顯示:模型組小鼠腎組織CXCL16表達(dá)水平與腎組織慢性指數(shù)、血、尿CXCL16水平以及血、腎組織ox-LDL水平、腎組織CXCR6表達(dá)呈明顯正相關(guān)性(P＜0.01);腎組織慢性指數(shù)與血、尿CXCL16水平以及血

13、、腎組織ox-LDL表達(dá)呈明顯正相關(guān)性(P＜0.01);血清CXCL16水平與腎組織ADAM10、血清IFNγ水平呈明顯正相關(guān)性(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ox-LDL水平及腎組織ox-LDL表達(dá)明顯增高，且隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，相關(guān)分析顯示血、腎組織ox-LDL水平與腎組織病理學(xué)慢性指數(shù)呈明顯正相關(guān)，提示ox-LDL參與了阿霉素腎病的發(fā)生發(fā)展，且與腎組織病理損害的嚴(yán)重程度有關(guān)。

14、
　　2.與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清、尿液及腎組織CXCL16水平明顯增高，且隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，相關(guān)分析顯示血、尿及腎組織CXCL16水平與腎組織病理學(xué)慢性指數(shù)呈明顯正相關(guān)，提示CXCL16可能參與了阿霉素腎病的發(fā)生發(fā)展，且與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。
　　3.血、尿CXCL16及腎CXCR6與腎組織水平CXCL16呈明顯正相關(guān)，提示腎組織中CXCL16與其受體CXCR6結(jié)合發(fā)揮作用，血清和尿液CXCL16水平可作為一

15、種無創(chuàng)傷性指標(biāo)，評(píng)價(jià)其腎臟病理損傷的嚴(yán)重程度。
　　4.模型組小鼠血清IFN-γ及腎組織ADAM10表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，相關(guān)分析顯示，模型組小鼠腎組織ADAM10表達(dá)及血清IFN-γ與血清CXCL16水平呈明顯正相關(guān)，提示ADAM10參與了結(jié)合型CXCL16與分泌型CXCL16的轉(zhuǎn)化，且這一轉(zhuǎn)化過程受炎性因子IFN-γ的調(diào)節(jié)。
　　5.相關(guān)分析顯示，腎組織CXCL16和腎組織ox-LDL呈明顯正相關(guān)，提示在阿霉素腎病發(fā)