IL-1β及ox-LDL對心室重構(gòu)的影響及他汀藥物的干預(yù)作用.pdf

1、急性心肌梗死(AMI)后的心室重構(gòu)是心室擴(kuò)張、心功能不全甚至死亡的主要原因，它是一個(gè)復(fù)雜的動態(tài)的而且是時(shí)間依賴性的過程。 動脈粥樣硬化(AS)是導(dǎo)致AMI發(fā)生的根本原因。目前認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)動態(tài)過程，涉及感染、炎癥、免疫多種機(jī)制。 AMI后的心室重構(gòu)是個(gè)復(fù)雜的過程，在此過程中，ox-LDL、IL-1β等多種因素介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解和合成的動態(tài)平衡得以打破，使得正常結(jié)構(gòu)的膠原組織降解，合成的無序的膠原纖維，使得心室重構(gòu)

2、的發(fā)生，最終導(dǎo)致心室功能不良。 第一部分：IL-1β對心肌成纖維細(xì)胞合成和降解膠原的影響 方法： 體外培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞。加入IL-1β(0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)干預(yù)24h后，觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法觀察細(xì)胞增殖情況，3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法觀察細(xì)胞DNA合成，3H-脯氨酸(3H-Pro)摻入法觀察膠原的合成。明教酶譜法觀察iMPs活

3、性，Western-blot觀察MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，RT-PCR觀察MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1.IL-1β作用于心肌成纖維細(xì)胞24h后，0.01ng/mlIL-1β對細(xì)胞增殖、DNA的合成沒有明顯影響。0.1ng/mlIL-1β可顯著性抑制細(xì)胞活性及減少3H-TdR摻入量(P<0.05)。隨著濃度增高，上述抑制作用逐漸增強(qiáng)，1～100ng/ml較0.1ng/ml組抑制作用明顯增強(qiáng)(P

4、<0.05)。 2.0.01ng/mlIL-1β干預(yù)24h后對CFs合成膠原無明顯影響。隨著濃度的升高，0.1ng/mlIL-1β即可顯著性抑制細(xì)胞膠原的合成(P<0.05)。1～100ng/mlIL-1β抑制細(xì)胞膠原合成的作用更強(qiáng)(P<0.01)，但10～100ng/ml之間作用無顯著性差異。 3.小劑量的IL-1β干預(yù)后，MMP-2的活性即升高，并呈濃度依賴性增高趨勢。同時(shí)MMP-9的活性也顯著性增高，與MMP-2不

5、同，0.01～1ng/mlIL-1β作用后MMP-9的升高程度無顯著性差異。 4.與空白對照組比較，IL-1β干預(yù)后可顯著性升高M(jìn)MP-2蛋白表達(dá)水平，按0.01～0.1ng/ml分別升高1.35倍和1.56倍(P<0.05)，1～100ng/ml分別升高2.15倍、2.34倍、2.41倍(P<0.01)。MMP-9蛋白表達(dá)也顯著性升高，按0.01ng/ml即可顯著性升高M(jìn)MP-9蛋白表達(dá)1.38倍(P<0.05)，0.1～10

6、0ng/ml分別2.37倍、2.56倍、2.60倍、2.67倍(P<0.01)。 5.IL-1β作用于CFs24小時(shí)后能濃度依賴性增加MMPsmRNA表達(dá)。與空白對照組比較，MMP-2mRNA表達(dá)能顯著性增加，按0.01ng/ml～100ng/ml不同濃度分別升高1.81倍(P<0.05)、2.17倍、2.18倍、2.27倍、2.31倍(P<0.01)。MMP-9mRNA表達(dá)也能顯著性升高，分別1.36倍(P<0.05)、1.4

7、9倍、1.50倍、1.51倍、1.52倍(P<0.01)。 結(jié)論： 一定濃度的IL-1β抑制CFs的增殖及DNA的合成，并可能通過該作用降低膠原的合成，同時(shí)IL-1β還能增加MMPs的活性，起到降解膠原的作用。上述作用呈濃度依賴性，與心肌梗死面積越大，炎癥因子濃度越高，心室重構(gòu)越嚴(yán)重相符合，提示IL-1β在心室重構(gòu)過程中起一定的作用。 第二部分：氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)對心肌成纖維細(xì)胞合成和降解膠原的影響

8、 方法： 分離并氧化低密度脂蛋白.體外培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，加入ox-LDL(10、20、50、100μg/ml)干預(yù)24h，觀察細(xì)胞形態(tài)，3H-TdR摻入法觀察細(xì)胞DNA合成，3H-Pro摻入法觀察細(xì)胞膠原的合成，明膠酶譜法測定基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9活性，Wostorn-blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1.o

9、x-LDL對細(xì)胞3H-TdR摻入率的影響與其濃度密切相關(guān)。用ox-LDL干預(yù)24h后可見10μg/ml和20μg/ml即顯著性增加細(xì)胞3H-TdR摻入率(P<0.05)，隨著濃度的增高(50～100μg/ml)，摻入率也隨之增高(P<0.01)，100μg/ml的增強(qiáng)作用最強(qiáng)。 2.ox-LDL對細(xì)胞3H-Pro摻入率的影響也與其濃度密切相關(guān)。用ox-LDL干預(yù)24h后可見10μg/ml即顯著性減少細(xì)胞3H-Pro摻入率(P<0

10、.05)，而隨著濃度的增高(20～100μg/ml)，摻入率也迅速降低(P<0.01)，100μg/ml的抑制作用最強(qiáng)。 3.ox-LDL干預(yù)24小時(shí)后能增加條件培養(yǎng)基中MMP-2和MMP-9的活性。 4.與空白對照組比較，10μg/ml的ox-LDL即能顯著性升高M(jìn)MP-2蛋白表達(dá)1.17倍(P<0.05)，而20～100μg/ml作用更強(qiáng)并呈濃度依賴性，分別升高1.32倍、1.42倍、1.53倍(P<0.01)。

11、 5.10～20μg/mlox-LDL使MMP-2mRNA表達(dá)分別升高1.01倍、1.07倍。而50～100μg/mlox-LDL則使MMP-2mRNA表達(dá)分別升高1.21倍、1.33倍，與前兩組和對照組比較，呈明顯上升趨勢。與對照組比較，10～20μg/mlox-LDL干預(yù)細(xì)胞24h后，對細(xì)胞MMP-9的mRNA表達(dá)無顯著性影響，而50μg/ml和100μg/mlox-LDL則顯著性升高M(jìn)MP-9的mRNA表達(dá)1.18倍和1.22

12、倍(P<0.05)。 結(jié)論： 高劑量的ox-LDL作用于心肌成纖維細(xì)胞后，能促進(jìn)細(xì)胞DNA合成，但減少細(xì)胞合成膠原并增加MMP-2和MMP-9的活性和mRNA表達(dá)。但低劑量的ox-LDL對mRNA的影響不大。提示ox-LDL可能使CFs變性，導(dǎo)致膠原合成減少。高劑量時(shí)能通過轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后水平影響MMPs分泌，而低劑量時(shí)只能通過轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)MMPs分泌，從而增加膠原的分解，促進(jìn)心室重構(gòu)的發(fā)生。 第三部分：辛伐他汀

13、(Sim)干預(yù)IL-1和ox-LDL對心肌成纖維細(xì)胞合成和降解膠原的影響 方法：分離并氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。體外培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，設(shè)立空白對照組、IL-1β組(10μg/ml)、Sim(10μmol/L)+IL-1β組(10ng/ml)、ox-LDL組(50μg/ml)、Sim(10μmol/L)+ox-LDL組(50μg/ml）、ox-LDL(50μg/ml)+IL-1β(10ng/ml)組、Sim(10μm

14、ol/L)+ox-LDL(50μg/ml)+IL-1β(10ng/ml)組。干預(yù)24h，觀察細(xì)胞形態(tài)，3H-TdR墩摻入法觀察細(xì)胞DNA合成，3H-Pro摻入法觀察膠原的合成，明膠酶譜法測定基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9活性，Westem-blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1.與對照組比較，IL-1β能使CFs的3H-TdR摻入率明顯降低

15、(P<0.05)，而ox-LDL使CFs3H-TdR摻入率顯著性升高(P<0.05)；IL-1β+ox-LDL組也明顯降低3H-TdR摻入率(P<0.05)，且與ox-LDL單獨(dú)作用相比較，有顯著性差異(P<0.01)。 2.與對照組相比，IL-1β和ox-LDL單獨(dú)作用時(shí)均能使CFs3H-Pro摻入率顯著性降低(P<0.01)；IL-1β+ox-LDL協(xié)同作用能使膠原的合成進(jìn)一步降低(P<0.01)，而且其與IL-1β組相比也

16、有顯著性差異(P<0.05). 3.IL-1β和ox-LDL單獨(dú)作用細(xì)胞后均能使MMP-2活性明顯升高(P<0.01)。兩者聯(lián)合應(yīng)用后，使得MMP-2活性更進(jìn)一步升高(P<0.01)。 4.與空白對照組比較，IL-1β和ox-LDL單獨(dú)干預(yù)細(xì)胞24h后，即能顯著性升高M(jìn)MP-2蛋白的表達(dá)，分別升高1.59倍和1.23倍(P<0.01)，兩者協(xié)同作用后，可使MMP-2水平進(jìn)一步升高到1.74倍，且與單因素作用組相比有顯著性

17、差異(P<0.05)。 5.與空白對照組比較，IL-1β和ox-LDL單獨(dú)干預(yù)細(xì)胞后，均能顯著性升高條件培養(yǎng)基中MMP-2mRNA的表達(dá)(分別升高1.57倍和1.37倍)，且IL-1β組升高程度較高(P<0.01)。兩者協(xié)同作用后，MMP-2mRNA水平進(jìn)一步升高至1.68倍(P<0.01)，與oxoLDL單獨(dú)作用相比，有顯著性差異，但與也IL-1β單獨(dú)作用相比，無明顯差異。 結(jié)論： IL-1β和ox-LDL聯(lián)合