Calreticulin蛋白在食管癌轉移中作用機制研究.pdf

1、食管癌的死亡率在我國惡性腫瘤中居第四位，鱗狀細胞癌是我國食管癌的主要病理類型。為了尋找與食管癌發(fā)生發(fā)展相關的分子變化，本課題組前期利用雙向電泳結合質譜技術分析了食管鱗狀細胞癌與癌旁正常食管上皮組織的蛋白差異表達譜發(fā)現Calreticulin蛋白在食管癌組織中表達升高，且Calreticulin蛋白高表達食管癌患者的五年生存率低于Calreticulin低表達患者。Calreticulin(CRT)是一個多功能的鈣離子結合蛋白，參與蛋白質

2、折疊、內質網鈣離子的貯存和釋放等多種細胞生命過程。對該蛋白在食管癌細胞中的作用進行深入研究顯示，敲降CRT可抑制細胞運動穿膜和Matrigel侵襲能力。論文旨在尋找CRT下游調節(jié)基因，揭示CRT在促進食管癌細胞運動侵襲中的分子機制。
　　 我們首先在食管鱗癌KYSE150細胞系中敲降CRT，用cDNA表達譜芯片分析敲降組與對照組相比轉錄水平改變的分子。RealtimePCR和Westernblot結果顯示，敲降CRT后PTPIB

3、在mRNA和蛋白水平均下調。在CRT缺失的細胞系中轉染pcDNA3.1-CRT(mutant)回復CRT表達，PTP1BmRNA和蛋白也隨之上調。本研究結果顯示，CRT通過調節(jié)PTPIB轉錄影響其表達。
　　 在食管癌KYSE150細胞系中，敲降PTP1B后，細胞侵襲運動能力減弱，黏附和凋亡能力不受影響。在CRT敲降細胞系中感染Lenti-PTP1B，可逆轉由CRT敲降導致的PTP1B降低，PTP1B可以恢復由于CRT降低導致的

4、細胞運動侵襲抑制。體內實驗顯示，敲降CRT、PTPIB均可抑制食管癌肺轉移。
　　 為了進一步研究CRT對PTP1B的調控機制，我們通過生物信息學分析了PTP1B基因上游啟動子序列，發(fā)現存在多個Stat5a的保守結合位點。實驗顯示降低CRT蛋白表達后，可以抑制Stat5a(Tyr694)的磷酸化水平。染色質免疫沉淀實驗顯示，Stat5a結合于PTP1B基因上游-676到-595位的TT(N)5AA保守序列。提示CRT以作為上游分

5、子，通過CRT-Stat5a-PTPIB途徑調節(jié)PTP1B基因的轉錄。
　　 MMPs家族在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用，MMP-9是其家族成員之一。我們研究發(fā)現CRT和PTPIB均可以調節(jié)MMP-9表達，且CRT敲降細胞外源感染Lenti-PTP1B，MMP-9回復升高。Erk1/2為MMP-9轉錄因子之一，我們驗證了在KYSE150細胞系中Erk1/2可以調控MMP-9轉錄，而CRT通過PTP1B影響Erk1/2磷酸化水平，從而影