Calreticulin蛋白在食管癌中的表達(dá)改變及其作用機(jī)制研究.pdf

1、食管癌的死亡率位居我國(guó)惡性腫瘤的第四位。為了尋找與食管痛關(guān)系密切的分子改變，本研究對(duì)食管癌及其手術(shù)切端粘膜組織進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析，得到了22個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的食管癌異常表達(dá)蛋白。從中挑選了5個(gè)可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用的候選蛋白，包括calreticulin、heat shock 70-kDa protein 5(GRP78)、Hsp27、annexin V和M2-PK。首先利用Western blot在4對(duì)食管癌組織和配對(duì)切端粘

2、膜組織中作了驗(yàn)證檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)calreticulin、GRP78、annexinV和M2-PK蛋白均在食管癌組織中存在過(guò)表達(dá)，而Hsp27在癌組織中表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步利用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析了近90例配對(duì)食管癌組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)calreticulin、GRP78、annexin V、M2-PK和Hsp27蛋白在食管癌組織中的異常表達(dá)均高于30％。Kaplan-Meier和log rank生存分析表明calreticulin和GRP78蛋白

3、高表達(dá)均與食管癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。 Calreticulin(CALR)是一個(gè)多功能的鈣離子結(jié)合蛋白，參與蛋白質(zhì)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的貯存和釋放等多種細(xì)胞生命過(guò)程，我們對(duì)該蛋白在食管癌細(xì)胞中的作用進(jìn)行了深入的研究。體外實(shí)驗(yàn)表明CALR-siRNA介導(dǎo)的CALR表達(dá)抑制不影響食管癌細(xì)胞的增殖和周期進(jìn)展，但可抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)穿膜、Matrigel侵襲、軟瓊脂集落形成和抗失巢凋亡能力，而且CALR過(guò)表達(dá)可以增加食管癌細(xì)胞的抗失巢凋亡能

4、力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，降低CALR表達(dá)可抑制裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，抑制CALR可以減弱F-actin的聚合并降低p63和粘著斑重要組分paxillin蛋白的表達(dá)。 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Cortactin(CTTN)也是通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞抗失巢凋亡的能力而促進(jìn)食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，抑制CALR蛋白可以降低CTTN的mRNA及蛋白表達(dá)，而CTTN蛋白降低不影響CALR蛋白的表達(dá)。生物信息學(xué)

5、分析CTTN基因上游啟動(dòng)子序列，顯示存在多個(gè)STAT3的保守結(jié)合位點(diǎn)，而且我們發(fā)現(xiàn)抑制CALR蛋白表達(dá)可以抑制STAT3(Tyr705)的磷酸化水平。JAK激酶抑制劑AG490處理細(xì)胞后可以降低CTTN蛋白而對(duì)CALR蛋白表達(dá)沒(méi)有影響。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，STAT3結(jié)合于CTTN因上游-1003到-996位的TTATGAA保守序列。提示CALR可以作為上游分子，通過(guò)CALR-STAT3-CTTN途徑調(diào)節(jié)CTTN基因的轉(zhuǎn)錄。利用激光共

6、聚焦和Co-IP技術(shù)還發(fā)現(xiàn)CALR和CTTN蛋白存在共定位和共沉淀，但是CALR并不影響CTTN蛋白的降解。 本研究首次發(fā)現(xiàn)降低CALR表達(dá)可以抑制體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的惡性表型，尤其揭示了CALR促進(jìn)食管癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和抵抗失巢凋亡等一系列新功能。CALR可以通過(guò)調(diào)節(jié)P13K/Akt途徑，并且間接通過(guò)STAT3調(diào)節(jié)CTTN的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)影響paxillin、p63的表達(dá)，賦予其高表達(dá)腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力和保護(hù)其脫離基質(zhì)后免于失巢