Calreticulin蛋白在食管癌中的表達改變及其作用機制研究.pdf

1、食管癌的死亡率位居我國惡性腫瘤的第四位。為了尋找與食管痛關(guān)系密切的分子改變，本研究對食管癌及其手術(shù)切端粘膜組織進行了蛋白組學分析，得到了22個具有統(tǒng)計學意義的食管癌異常表達蛋白。從中挑選了5個可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用的候選蛋白，包括calreticulin、heat shock 70-kDa protein 5(GRP78)、Hsp27、annexin V和M2-PK。首先利用Western blot在4對食管癌組織和配對切端粘

2、膜組織中作了驗證檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)calreticulin、GRP78、annexinV和M2-PK蛋白均在食管癌組織中存在過表達，而Hsp27在癌組織中表達下調(diào)。進一步利用免疫組織化學技術(shù)分析了近90例配對食管癌組織標本，發(fā)現(xiàn)calreticulin、GRP78、annexin V、M2-PK和Hsp27蛋白在食管癌組織中的異常表達均高于30％。Kaplan-Meier和log rank生存分析表明calreticulin和GRP78蛋白

3、高表達均與食管癌患者的不良預后顯著相關(guān)。 Calreticulin(CALR)是一個多功能的鈣離子結(jié)合蛋白，參與蛋白質(zhì)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的貯存和釋放等多種細胞生命過程，我們對該蛋白在食管癌細胞中的作用進行了深入的研究。體外實驗表明CALR-siRNA介導的CALR表達抑制不影響食管癌細胞的增殖和周期進展，但可抑制細胞運動穿膜、Matrigel侵襲、軟瓊脂集落形成和抗失巢凋亡能力，而且CALR過表達可以增加食管癌細胞的抗失巢凋亡能

4、力。體內(nèi)實驗顯示，降低CALR表達可抑制裸鼠皮下瘤生長。進一步的分子機制研究發(fā)現(xiàn)，抑制CALR可以減弱F-actin的聚合并降低p63和粘著斑重要組分paxillin蛋白的表達。 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，細胞骨架相關(guān)蛋白Cortactin(CTTN)也是通過增加腫瘤細胞抗失巢凋亡的能力而促進食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，抑制CALR蛋白可以降低CTTN的mRNA及蛋白表達，而CTTN蛋白降低不影響CALR蛋白的表達。生物信息學

5、分析CTTN基因上游啟動子序列，顯示存在多個STAT3的保守結(jié)合位點，而且我們發(fā)現(xiàn)抑制CALR蛋白表達可以抑制STAT3(Tyr705)的磷酸化水平。JAK激酶抑制劑AG490處理細胞后可以降低CTTN蛋白而對CALR蛋白表達沒有影響。染色質(zhì)免疫沉淀實驗顯示，STAT3結(jié)合于CTTN因上游-1003到-996位的TTATGAA保守序列。提示CALR可以作為上游分子，通過CALR-STAT3-CTTN途徑調(diào)節(jié)CTTN基因的轉(zhuǎn)錄。利用激光共

6、聚焦和Co-IP技術(shù)還發(fā)現(xiàn)CALR和CTTN蛋白存在共定位和共沉淀，但是CALR并不影響CTTN蛋白的降解。 本研究首次發(fā)現(xiàn)降低CALR表達可以抑制體內(nèi)外腫瘤細胞的惡性表型，尤其揭示了CALR促進食管癌細胞的運動、侵襲和抵抗失巢凋亡等一系列新功能。CALR可以通過調(diào)節(jié)P13K/Akt途徑，并且間接通過STAT3調(diào)節(jié)CTTN的轉(zhuǎn)錄，同時影響paxillin、p63的表達，賦予其高表達腫瘤細胞較強的運動能力和保護其脫離基質(zhì)后免于失巢