調節(jié)性和效應性T細胞在膽道閉鎖小鼠免疫炎癥發(fā)展中的作用及影響.pdf

1、目的：研究調節(jié)性T細胞（Treg）和效應性Th17細胞（Th17）在膽道閉鎖（BA）小鼠免疫炎癥發(fā)展中的作用；并過繼輸注Treg細胞或注射IL-17中和抗體，進一步明確Treg/Th17細胞在膽道閉鎖免疫學發(fā)病機制中的作用。
　　方法：利用RRV建立膽道閉鎖小鼠模型，新生Balb/c小鼠隨機分為以下四組：1，正常組：出生后24h內腹腔注射生理鹽水；2，輪狀病毒組：出生后24h內腹腔注射RRV；3，Treg細胞組：出生后12h內腹腔

2、過繼輸注Treg細胞，隨后12h內注射RRV；4，IL-17抗體組：出生后12h內注射RRV，隨后連續(xù)兩天注射不同劑量（15μg，30μg，50μg）IL-17中和抗體。觀察各組小鼠在不同時期的表型及組織病理學等變化；利用實時定量PCR（RT-qPCR）和Western blot分別檢測各組小鼠肝臟組織中Foxp3，IL-17A以及ROR-γt基因和蛋白表達；利用免疫組織化學檢測各組小鼠肝臟組織中CD4+細胞、Foxp3+Treg細胞及

3、IL-17+Th17細胞表達部位及變化；流式細胞術檢測各組小鼠肝臟組織中Treg細胞及Th17細胞比例變化。利用ELISA檢測小鼠肝臟組織中炎性細胞因子變化，以及肝臟組織DC細胞的TLRs表達情況。分離DC細胞、CD4+T細胞并進行培養(yǎng)，利用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6表達區(qū)別。體外利用細胞共培養(yǎng)，觀察 Treg細胞對Th17細胞分化的抑制作用，觀察膽道閉鎖小鼠體內Treg細胞抑制功能的變化。
　　結果：正常組23只，3天

4、內死亡1只，無1例出現發(fā)育遲緩和膽汁淤積癥狀，其余小鼠均健康存活到21天。24只輪狀病毒組小鼠中發(fā)生膽道閉鎖的有18只（75.0％），以發(fā)育遲緩（體重增長緩慢或停滯）和膽汁淤積（無毛區(qū)皮膚黃染，大便陶土樣）為主要癥狀；肝臟大體觀見淤膽明顯，表面顆粒狀，肝外膽管呈索條狀，膽囊顯示不清；肝臟及膽管組織切片HE染色可見肝外膽管閉鎖，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤。膽道閉鎖小鼠肝臟組織中Foxp3，IL-17和ROR-γt基因及蛋白表達均明顯高于正常組

5、，在第7天達到峰值；免疫組織化學顯示膽道閉鎖小鼠肝臟組織尤其是匯管區(qū)中CD4+細胞、Foxp3+Treg細胞及IL-17+Th17細胞均顯著增加；流式細胞術發(fā)現膽道閉鎖小鼠肝臟組織中Treg細胞比例降低，而Th17細胞比例升高；膽道閉鎖小鼠肝臟組織中IL-2、IL-4、IL-5、TGF-β1、IL-10，IL-17，IL-12、IL-23、IFN-γ和IL-6均高于正常對照組。膽道閉鎖小鼠肝臟DC細胞中TLR3、7、8基因和蛋白均高于正

6、常對照組。膽道閉鎖小鼠肝臟DC細胞中IL-6明顯高于正常對照組，而CD4+T細胞中IL-6分泌無明顯差異。細胞共培養(yǎng)發(fā)現Treg細胞能抑制Th17細胞產生，而膽道閉鎖小鼠中Treg細胞抑制功能降低。過繼輸注Treg細胞后，小鼠膽道閉鎖發(fā)生率降低到23.1％，肝臟炎性表現明顯減輕，小鼠生存期延長，肝臟組織中Th17細胞相關基因和蛋白較膽道閉鎖小鼠明顯降低，免疫組織化學檢測發(fā)現IL-17+細胞表達減少，流式細胞術發(fā)現肝臟組織中Th17細胞比

7、例降低（P<0.05）；注射不同劑量IL-17中和抗體后，小鼠膽道閉鎖發(fā)生率均有不同程度降低，以注射50μg抗體組有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而且肝臟組織尤其是匯管區(qū)炎性表現減輕，伴隨有小鼠生存期延長，進一步研究發(fā)現注射50μg IL-17抗體組的小鼠肝臟組織中IL-17+蛋白較病毒組明顯減少（P<0.05），而免疫組化發(fā)現肝臟組織匯管區(qū)IL-17+細胞表達較病毒組明顯減少（P<0.05）。
　　結論：1.病毒感染后，引起肝臟微

8、環(huán)境改變以及TLRs依賴的DC細胞等變化，進而導致小鼠體內Treg細胞減少及功能降低，而Th17細胞增多，二者失衡在膽道閉鎖膽管損傷的進行性炎癥中發(fā)揮著重要作用。
　　2.過繼輸注Treg細胞后能明顯改善小鼠膽道閉鎖表型，延長生存期，減輕體內炎癥表現，表明Treg細胞對病毒感染后的炎性反應起抑制作用，為膽道閉鎖的防治提出了可能。
　　3.通過注射IL-17中和抗體，可以達到使小鼠膽道閉鎖表型降低，生存期延長的目的，減輕體內炎