人記憶性T細(xì)胞的調(diào)控及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中作用的研究.pdf

1、第一部分EZH2通過(guò)Notch/Bcl-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控人記憶性T細(xì)胞
　　目的：研究EZH2在人記憶性T細(xì)胞調(diào)控過(guò)程中的作用以及其相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：用Ficoll密度梯度分離法從人外周血中提取CD3+T細(xì)胞,用抗CD3/CD28抗體在體外進(jìn)行誘導(dǎo)增生。加入DZNep共培養(yǎng)以抑制T細(xì)胞上EZH2的表達(dá),用含EZH2靶序列shRNA的慢病毒感染T細(xì)胞以從基因水平特異性的敲除T細(xì)胞EZH2的表達(dá)。用流式細(xì)胞儀來(lái)分析T

2、細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子分泌情況,用Annexin V和7-AAD染色來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞的凋亡情況,用BrdU和7-AAD染色來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞的細(xì)胞周期。用PCR來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞中基因表達(dá)情況。用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞上蛋白表達(dá)情況。用染色質(zhì)免疫沉淀來(lái)檢測(cè)EZH2在Notch抑制子啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)節(jié)情況。用小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型來(lái)驗(yàn)證EZH2對(duì)T細(xì)胞在體內(nèi)抗腫瘤免疫中的作用。用免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)組織中T細(xì)胞上EZH2的表達(dá)。
　　結(jié)果：人初生T細(xì)胞

3、中EZH2表達(dá)有限,EZH2+T細(xì)胞有更高的增生潛能和更多的記憶性細(xì)胞特性。抑制T細(xì)胞上EZH2的表達(dá)能夠?qū)е耇細(xì)胞增生受限和凋亡增加。抑制EZH2表達(dá)可以削弱T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌功能并且使其保護(hù)性抗腫瘤免疫功能受損。EZH2通過(guò)H3K27me3抑制Notch抑制子的表達(dá),從而間接的調(diào)節(jié)Notch通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),Notch轉(zhuǎn)而通過(guò)Bcl-2調(diào)節(jié)T細(xì)胞的生存。潰瘍性結(jié)腸炎患者組織中T細(xì)胞高表達(dá)EZH2,并具有較多的記憶性細(xì)胞特性。

4、　　結(jié)論：內(nèi)態(tài)自穩(wěn)機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞上EZH2的表達(dá)水平有限,而在病理?xiàng)l件下T細(xì)胞上EZH2表達(dá)增高。EZH2調(diào)控人記憶性T細(xì)胞的增生、凋亡和細(xì)胞因子分泌功能,并且在T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性抗腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。Notch/Bcl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EZH2介導(dǎo)的記憶性T細(xì)胞調(diào)控過(guò)程中有著重要的作用。調(diào)節(jié)記憶性T細(xì)胞上EZH2的表達(dá)有可能為治療自身免疫性疾病和腫瘤等人類疾病提供一種有效的治療途徑。
　　第二部分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在前列腺癌患

5、者骨髓微環(huán)境中的作用
　　目的：研究前列腺癌患者骨髓微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用。
　　方法：提取人外周血和骨髓吸取物,用流式分析免疫細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子。分選CD4+CD25high T細(xì)胞來(lái)進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),免疫抑制實(shí)驗(yàn)和與DC共培養(yǎng)以檢測(cè)Treg細(xì)胞增生。用ELISA檢測(cè)骨髓中CXCL12水平,用PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況。提取小鼠骨髓細(xì)胞并用RANKL,M-CSF或活化T細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。用骨密度掃描儀檢測(cè)脛骨骨小梁的骨礦

6、物質(zhì)密度和內(nèi)容物。用人前列腺癌小鼠嵌合模型和體內(nèi)去除Treg細(xì)胞小鼠模型來(lái)檢測(cè)體內(nèi)Treg細(xì)胞在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用。
　　結(jié)果：前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者骨髓中Treg細(xì)胞水平明顯增高,CXCR4/CXCL12信號(hào)通路有助于Treg細(xì)胞向骨髓遷移。骨髓中Treg細(xì)胞呈現(xiàn)活躍的細(xì)胞周期,骨髓中DC表達(dá)大量的RANK并能通過(guò)RANK/RANKL信號(hào)通路促進(jìn)Treg細(xì)胞的增生。Treg細(xì)胞在體外抑制破骨細(xì)胞的分化。移植的Treg細(xì)胞遷移到骨

7、髓并能增加小鼠脛骨骨小梁的骨礦物質(zhì)密度和改善破骨細(xì)胞對(duì)骨小梁的破壞。體內(nèi)去除Treg細(xì)胞則造成荷瘤小鼠脛骨骨小梁骨礦物質(zhì)密度降低。
　　結(jié)論：骨髓中Treg細(xì)胞可能形成一個(gè)免疫抑制的小生態(tài)環(huán)境從而有利于癌細(xì)胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移并造成骨沉積這一前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者主要的骨病理學(xué)變化。我們的結(jié)果從機(jī)制上闡述了Treg細(xì)胞集聚于骨髓中的原因并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Treg細(xì)胞在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者中的新作用。我們的發(fā)現(xiàn)預(yù)示著Treg細(xì)胞為靶向的治療不僅能改善機(jī)