人記憶性T細胞的調(diào)控及調(diào)節(jié)性T細胞在骨髓微環(huán)境中作用的研究.pdf

1、第一部分EZH2通過Notch/Bcl-2信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控人記憶性T細胞
　　目的：研究EZH2在人記憶性T細胞調(diào)控過程中的作用以及其相應(yīng)的調(diào)控機制。
　　方法：用Ficoll密度梯度分離法從人外周血中提取CD3+T細胞,用抗CD3/CD28抗體在體外進行誘導增生。加入DZNep共培養(yǎng)以抑制T細胞上EZH2的表達,用含EZH2靶序列shRNA的慢病毒感染T細胞以從基因水平特異性的敲除T細胞EZH2的表達。用流式細胞儀來分析T

2、細胞的表型和細胞因子分泌情況,用Annexin V和7-AAD染色來檢測T細胞的凋亡情況,用BrdU和7-AAD染色來檢測T細胞的細胞周期。用PCR來檢測T細胞中基因表達情況。用蛋白印跡實驗來檢測T細胞上蛋白表達情況。用染色質(zhì)免疫沉淀來檢測EZH2在Notch抑制子啟動子區(qū)域的調(diào)節(jié)情況。用小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型來驗證EZH2對T細胞在體內(nèi)抗腫瘤免疫中的作用。用免疫熒光染色來檢測組織中T細胞上EZH2的表達。
　　結(jié)果：人初生T細胞

3、中EZH2表達有限,EZH2+T細胞有更高的增生潛能和更多的記憶性細胞特性。抑制T細胞上EZH2的表達能夠?qū)е耇細胞增生受限和凋亡增加。抑制EZH2表達可以削弱T細胞的細胞因子分泌功能并且使其保護性抗腫瘤免疫功能受損。EZH2通過H3K27me3抑制Notch抑制子的表達,從而間接的調(diào)節(jié)Notch通路的信號轉(zhuǎn)導,Notch轉(zhuǎn)而通過Bcl-2調(diào)節(jié)T細胞的生存。潰瘍性結(jié)腸炎患者組織中T細胞高表達EZH2,并具有較多的記憶性細胞特性。

4、　　結(jié)論：內(nèi)態(tài)自穩(wěn)機體內(nèi)T細胞上EZH2的表達水平有限,而在病理條件下T細胞上EZH2表達增高。EZH2調(diào)控人記憶性T細胞的增生、凋亡和細胞因子分泌功能,并且在T細胞介導的保護性抗腫瘤免疫過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。Notch/Bcl信號轉(zhuǎn)導通路在EZH2介導的記憶性T細胞調(diào)控過程中有著重要的作用。調(diào)節(jié)記憶性T細胞上EZH2的表達有可能為治療自身免疫性疾病和腫瘤等人類疾病提供一種有效的治療途徑。
　　第二部分調(diào)節(jié)性T細胞在前列腺癌患

5、者骨髓微環(huán)境中的作用
　　目的：研究前列腺癌患者骨髓微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細胞的作用。
　　方法：提取人外周血和骨髓吸取物,用流式分析免疫細胞的表型和細胞因子。分選CD4+CD25high T細胞來進行遷移實驗,免疫抑制實驗和與DC共培養(yǎng)以檢測Treg細胞增生。用ELISA檢測骨髓中CXCL12水平,用PCR檢測基因表達情況。提取小鼠骨髓細胞并用RANKL,M-CSF或活化T細胞誘導破骨細胞分化。用骨密度掃描儀檢測脛骨骨小梁的骨礦

6、物質(zhì)密度和內(nèi)容物。用人前列腺癌小鼠嵌合模型和體內(nèi)去除Treg細胞小鼠模型來檢測體內(nèi)Treg細胞在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用。
　　結(jié)果：前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者骨髓中Treg細胞水平明顯增高,CXCR4/CXCL12信號通路有助于Treg細胞向骨髓遷移。骨髓中Treg細胞呈現(xiàn)活躍的細胞周期,骨髓中DC表達大量的RANK并能通過RANK/RANKL信號通路促進Treg細胞的增生。Treg細胞在體外抑制破骨細胞的分化。移植的Treg細胞遷移到骨

7、髓并能增加小鼠脛骨骨小梁的骨礦物質(zhì)密度和改善破骨細胞對骨小梁的破壞。體內(nèi)去除Treg細胞則造成荷瘤小鼠脛骨骨小梁骨礦物質(zhì)密度降低。
　　結(jié)論：骨髓中Treg細胞可能形成一個免疫抑制的小生態(tài)環(huán)境從而有利于癌細胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移并造成骨沉積這一前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者主要的骨病理學變化。我們的結(jié)果從機制上闡述了Treg細胞集聚于骨髓中的原因并發(fā)現(xiàn)了一個Treg細胞在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者中的新作用。我們的發(fā)現(xiàn)預(yù)示著Treg細胞為靶向的治療不僅能改善機