調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在小鼠免疫介導(dǎo)肝炎中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在調(diào)節(jié)免疫耐受和免疫反應(yīng)中起著重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增，得以限制變態(tài)反應(yīng)疾病、感染、移植、移植物抗宿主反應(yīng)和癌癥中的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，達(dá)到調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的目的。 肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)器官，是體內(nèi)物質(zhì)代謝和解毒的重要場所。肝臟內(nèi)的免疫系統(tǒng)持續(xù)接觸從腸道來源的食物抗原及微生物。因此，肝臟內(nèi)的免疫和耐受需要處于一種動態(tài)平衡。肝炎是世界性范圍內(nèi)的一種重大疾病。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在外周耐受中起關(guān)鍵作用。

2、然而，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是否參與了維持肝臟內(nèi)生理狀態(tài)以及控制病理免疫反應(yīng)還不清楚。目前，關(guān)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝臟內(nèi)生理以及病理免疫反應(yīng)中作用的報(bào)道十分有限。 刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)誘導(dǎo)肝炎是一種已經(jīng)建立好的急性肝炎的動物模型，主要通過快速活化多克隆T細(xì)胞(主要為CD4+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞)來實(shí)現(xiàn)自身免疫損傷。ConA誘導(dǎo)的肝炎其特征是血清轉(zhuǎn)氨酶水平迅速升高，血清中含有大量細(xì)胞因子，肝臟出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞壞

3、死和凋亡。這種由ConA誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)過度活化所引起的肝臟急性損傷可以在短時(shí)間內(nèi)自我恢復(fù)。在ConA誘導(dǎo)的肝炎模型中，影響免疫系統(tǒng)自我調(diào)控能力的機(jī)制仍不清楚。本研究的目的，是探討在這種免疫介導(dǎo)肝臟損傷模型中的調(diào)節(jié)因素。 1.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過TGF-β抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎 在本研究中，我們使用ConA誘導(dǎo)的肝炎模型作為平臺，研究肝臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝臟損傷中的作用。我們通過給小鼠注射ConA來建立ConA誘導(dǎo)肝臟損傷的模型

4、。通過對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的檢測以及組織病理學(xué)的觀察，確定肝臟損傷情況。通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，檢測肝臟以及脾臟內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例變化情況，并對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行絕對數(shù)量的計(jì)數(shù)。通過流式細(xì)胞術(shù)，我們還對肝臟內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行表型分析。我們通過系統(tǒng)性清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸?shù)绞荏w鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)，研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ConA模型中的作用。為了研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ConA模型中發(fā)揮作用的機(jī)理，我們用ELISA的方法檢測了小鼠血清中細(xì)胞因

5、子的水平，并且通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測了肝臟內(nèi)細(xì)胞因子的水平。最后，為了在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭写_認(rèn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ConA模型中的作用，我們使用了4小時(shí)谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase，AST)釋放法檢測了肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞對肝細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。 結(jié)果顯示，肝臟損傷的恢復(fù)需要調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的存在。ConA注射可以在早期誘導(dǎo)出一群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。ConA處理伴隨著肝臟內(nèi)Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及絕對數(shù)目的顯著增

6、加，這種增加在ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷過程中持續(xù)存在。脾臟內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并沒有明顯的變化。對細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3熒光染色的實(shí)驗(yàn)表明，在經(jīng)過ConA處理的小鼠中，其肝臟中CD4+T細(xì)胞Foxp3的表達(dá)水平明顯升高，而脾臟中的Foxp3表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。除了Foxp3分子外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體(GITR)，以及CD103分子的表達(dá)都有所上升，而CD45R

7、B和CD62L的表達(dá)變化不明顯。 我們通過使用抗-CD25的單克隆抗體(克隆號：PC61.5.3)來系統(tǒng)性清除小鼠體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，以便在體內(nèi)研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ConA模型中的相關(guān)功能。經(jīng)過抗-CD25單克隆抗體處理的小鼠，肝臟內(nèi)表達(dá)Foxp3的CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯降低，這說明小鼠體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以被該抗體所清除。清除CD25+細(xì)胞加重ConA誘導(dǎo)的肝炎。經(jīng)過抗-CD25抗體處理的小鼠與經(jīng)過對照抗體處理的小鼠相比，由Co

8、nA所誘導(dǎo)的血清ALT水平的升高更為明顯，肝臟的壞死程度也明顯加重。與之對應(yīng)的，我們純化了肝臟的CD25+單個(gè)核細(xì)胞，用于繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)。過繼轉(zhuǎn)輸肝臟CD25+單個(gè)核細(xì)胞可以減輕由ConA引起的肝臟損傷。與轉(zhuǎn)輸了未經(jīng)處理的肝臟單個(gè)核細(xì)胞的對照小鼠相比，轉(zhuǎn)輸了肝臟CD25+單個(gè)核細(xì)胞的受體小鼠中，由ConA所引起的血清ALT水平的升高明顯受到抑制，并且其肝臟中只顯示出輕微損傷。 最后，我們研究了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ConA模型中發(fā)揮作用的機(jī)

9、理。在ConA處理的小鼠中，血清中TGF-β1含量以及肝臟單個(gè)核細(xì)胞中TGF-β1mRNA的表達(dá)都明顯上升；清除小鼠體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抑制這種由ConA引起的TGF-β1的升高。相比而言，清除小鼠體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并不能降低ConA處理小鼠血清及肝臟內(nèi)IL-10的水平。除此之外，在體外實(shí)驗(yàn)中，ConA處理過的肝臟單個(gè)核細(xì)胞對小鼠的原代肝細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用；通過在培養(yǎng)體系中加入經(jīng)過ConA處理的肝臟CD25+單個(gè)核細(xì)胞，可以抑制這

10、種細(xì)胞毒活性；肝臟CD25+單個(gè)核細(xì)胞的這種抑制作用，可以通過加入抗-TGF-β單克隆抗體，中和培養(yǎng)體系中的TGF-β1來阻斷。 2.IL-2對免疫性肝炎的調(diào)節(jié)作用 由于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面組成性表達(dá)IL-2Rα(CD25)，以及對IL-2的應(yīng)答特性，我們比較了各種T細(xì)胞(主要常規(guī)T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)對IL-2的應(yīng)答能力和相互關(guān)系。我們通過不同的注射策略，用白細(xì)胞介素-2(interleukin2，IL-

11、2)對小鼠進(jìn)行預(yù)處理，研究IL-2在ConA模型中的調(diào)節(jié)作用。IL-2的注射策略分為兩種：一次性高劑量IL-2(2500單位每克體重)注射和多次低劑量IL-2(500單位每克體重，4次)注射。我們通過這兩種策略給小鼠預(yù)先注射IL-2，然后在小鼠上建立ConA誘導(dǎo)肝炎模型。我們檢測了這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中，IL-2的處理對ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷的影響。 一次性高劑量IL-2預(yù)注射可以減輕由ConA引起的肝臟損傷。高劑量IL-2預(yù)注射可以

12、使受到致死劑量ConA注射的小鼠免于死亡。在亞致死劑量ConA注射時(shí)，高劑量IL-2預(yù)注射使小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平比對照小鼠顯著降低，肝臟損傷也較輕。高劑量IL-2可以減少ConA注射后肝臟對T細(xì)胞的招募，并且降低T細(xì)胞上CD122和CD25的表達(dá)，而對Fas的表達(dá)沒有影響。這提示了高劑量IL-2可以負(fù)調(diào)節(jié)自身應(yīng)答性效應(yīng)T細(xì)胞活化，但并不通過AICD導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞凋亡。一次性高劑量IL-2注射對CD4+CD25+T細(xì)胞的數(shù)量和表而CTLA-

13、4、CD103、CD45RB和CD62L的表達(dá)影響不大，提示一次性高劑量IL-2預(yù)注射對肝臟的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞關(guān)系不大。此外，高劑量IL-2處理可以提高ConA模型中起保護(hù)作用的細(xì)胞因子IL-6和IL-10的表達(dá)水平，并且降低造成肝臟損傷的細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)。 多次低劑量IL-2預(yù)注射可以加重由ConA引起的肝臟損傷。低劑量IL-2注射會導(dǎo)致由ConA引起的小鼠血清ALT水平增高更為顯著，并且造成三分之一的小鼠死亡。

14、低劑量IL-2注射可以誘導(dǎo)肝臟和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量和比例增加。同時(shí)，和單純ConA注射的小鼠相比，低劑量IL-2注射可以使ConA模型中的肝臟和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量和比例增加更為顯著。這群具有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型的細(xì)胞是否具有負(fù)調(diào)節(jié)功能或者這群細(xì)胞是否直接具有類似效應(yīng)T細(xì)胞的功能有待進(jìn)一步研究。 綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ConA的處理伴隨著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的顯著增多，調(diào)節(jié)性T