調(diào)節(jié)性、效應性T細胞和樹突狀細胞在膽道閉鎖患兒免疫炎癥發(fā)展中的作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:研究CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、效應性Th17細胞(Th17)、樹突狀細胞(DC)及Toll 樣受體(TLR)在膽道閉鎖(BA)患兒免疫炎癥發(fā)展中的作用;并通過小鼠模型,觀察通過注射IL-6中和抗體抑制Th17細胞分化對膽道閉鎖發(fā)病的影響。
   研究方法:收集32例膽道閉鎖和18例對照組患兒(非膽道疾?。└闻K和外周血標本。實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-RT-PCR)及免疫組織化學方法檢測肝臟組

2、織Foxp3、IL-17、ROR-γt的mRNA 及蛋白表達;流式細胞術檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞和Th17細胞占CD4+T細胞比例;ELISA 法檢測血清中相關細胞因子IL-10、TGF-β、IL-17、IL-6、IFN-γ、IL-12的表達;分離外周血樹突狀細胞(DC),CD4+T和CD8+T細胞,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-6的表達變化;將T 淋巴細胞和DC細胞混合培養(yǎng),ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-1

3、7的表達;Q-RT-PCR,Western blot 及免疫熒光檢測DC細胞TLR3、7、8 mRNA 及蛋白的表達。應用恒河猴輪狀病毒(RRV)建立膽道閉鎖小鼠模型,將新生Balb/c 鼠隨機分為正常對照組,病毒對照組和IL-6 抗體組,正常對照組腹腔注射病毒培養(yǎng)液,即含2%胎牛血清的最低必須培養(yǎng)基(2%FCS-MEM),病毒對照組腹腔注射RRV,IL-6 抗體組在腹腔注射RRV 之后的24 小時按注射劑量分4組注射IL-6中和抗體,

4、分別為5μg,15μg,20μg,25μg,觀察小鼠的臨床表現(xiàn)及其組織病理學變化。應用實時定量熒光PCR(Q-RT-PCR)分別檢測正常對照組,病毒對照組,IL-6 抗體組小鼠出生4、7、10、14、21天肝臟Foxp3,IL-17,ROR-γt mRNA的表達;分離脾臟樹突狀細胞(DC),CD4+T和CD8+T細胞,ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-6的表達變化;將T 淋巴細胞和DC細胞混合培養(yǎng),ELISA 法檢測培養(yǎng)上清中IL-1

5、7的表達;Q-RT-PCR檢測DC細胞TLR3、7、8 mRNA的表達。
   實驗結(jié)果:免疫組織化學顯示BA組肝組織匯管區(qū)Treg和Th17細胞明顯比對照組增多,肝臟Foxp3、ROR-γt,IL-17的mRNA 及蛋白表達量也顯著高于對照組患兒。BA組中血清TGF-β、IL-10(Treg 相關因子)、IL-17(Th17 相關因子)、IL-12、IFN-γ(Th1 相關因子)和IL-6 均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。

6、其中IL-6升高24 倍,最為明顯。流式細胞學檢查顯示外周血Th17/CD4+T 比例顯著高于對照組;Treg/CD4+T細胞比例無差異;而同一患者中Treg/Th17 比例顯著低于對照組。體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)BA組DC細胞培養(yǎng)上清的IL-6 明顯增高;BA組PMBC+DC細胞+TGF-β培養(yǎng)上清中IL-17表達增高;DC細胞TLR3、7、8的表達顯著高于對照組。94只病毒對照組小鼠中64只小鼠發(fā)生BA(71.91%),出現(xiàn)發(fā)育遲緩(表現(xiàn)為

7、體重增加緩慢、停滯)和膽汁淤積(表現(xiàn)為無毛區(qū)黃疸、尿色深黃、陶土樣大便)癥狀。肝臟大體觀可見明顯黃染,表面呈顆粒狀,肝外膽管呈索條狀閉鎖,膽囊顯示不清,組織切片蘇木素伊紅染色(HE)顯示肝內(nèi)外膽管閉鎖;其中壽命達到或超過21d的小鼠僅4只(包括21天取材2只),比例為6.25%;無小鼠退黃(0%);193只IL-6 抗體組小鼠中,5μg、15μg、20μg 注射劑量組各48只,分別有34只(73.91%)、33只(70.21%)、29只

8、(61.71%)出現(xiàn)上述表現(xiàn),25μg 注射劑量組49只,有25只(52.08%)小鼠出現(xiàn)上述表現(xiàn),顯著低于病毒對照組;壽命超過或達到21d的BA 小鼠2只,比例為9.52%;4只小鼠自然退黃,體重逐漸恢復,比例為16%,顯著高于病毒對照組;31只對照組小鼠觀察至21天沒有上述表現(xiàn)。病毒對照組小鼠肝組織內(nèi)Foxp3,IL-17,ROR-γt mRNA表達在第7-10天顯著高于正常組和25ug 劑量的IL-6 抗體組。體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)病毒

9、對照組小鼠DC細胞培養(yǎng)上清的IL-6 明顯增高;病毒對照組小鼠T細胞+DC細胞+TGF-β培養(yǎng)上清中IL-17表達增高;DC細胞TLR3、7、8的表達顯著高于對照組。
   實驗結(jié)論:
   1.BA 患兒中Th17細胞增多、IL-17 水平增高而Treg細胞相對減少在BA的進行性免疫炎癥中發(fā)揮重要作用。
   2.BA中DC細胞通過TLRs 識別病原微生物而活化,分泌大量IL-6,促進Th17細胞分化,而抑制T

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