調(diào)節(jié)性T細胞在poly I-C-D-GalN誘發(fā)的肝臟損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：我們前期的研究發(fā)現(xiàn)病毒模擬物polyI:C和致敏劑D-GalN聯(lián)合注射可以誘發(fā)急性肝損傷,該損傷主要是由天然免疫細胞介導,其中Kupffer細胞和NK細胞起到重要作用。而且我們發(fā)現(xiàn)該損傷可以自愈。而調(diào)節(jié)性T細胞具有顯著的免疫抑制作用,并且被證實在ConA誘導的急性肝炎中對限制肝臟損傷起了重要作用。所以我們推測調(diào)節(jié)性T細胞同樣可以限制polyI:C/D-GalN誘導的肝臟損傷。Rag1-/-小鼠(lymphocyte-deficie

2、ntrecombinaseactivatinggene-1-null)是淋巴細胞缺陷鼠,沒有T、B細胞,是目前國際上研究調(diào)節(jié)性T細胞功能的常用小鼠。本文主要觀察比較野生型C57BL/6小鼠、以及抗體清除調(diào)節(jié)性T細胞的C57BL/6小鼠以及過繼轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細胞的Rag1-/-小鼠在polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射后誘發(fā)的爆發(fā)性肝炎模型中的肝臟損傷程度輕重以及相關炎性因子的動態(tài)變化,探討調(diào)節(jié)性T細胞在polyI:C/D-GalN誘發(fā)的急

3、性肝臟損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法：建立polyI:C/D-GalN誘發(fā)的爆發(fā)性肝炎小鼠模型,于感染后12,18,24,和48小時剖殺小鼠,測定野生型C57BL/6小鼠和Rag1-/-小鼠在各個時間點血清ALT活性;肝臟石蠟切片,HE染色后觀察比較野生型C57BL/6小鼠和Rag1-/-小鼠在各個時間點肝臟炎癥反應的輕重;用實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法,檢測比較野生型C57BL/6小鼠和Rag1-/-小鼠在各個時間點

4、肝臟TNF-α和IFN-γmRNA水平;ELISA法檢測比較野生型C57BL/6小鼠和Rag1-/-小鼠在各個時間點血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平;進一步用抗-CD25抗體(mAb,clonePC61.5.3)清除調(diào)節(jié)性T細胞,清除鼠和野生型小鼠用polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射后,觀察比較野生型小鼠和清除鼠肝臟的炎癥損傷程度以及各個時間點肝臟TNF-α和IFN-γmRNA水平以及血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平的區(qū)別;然后給

5、Rag1-/-小鼠轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細胞之后polyI:C/D-GalN注射,檢測血清ALT活性以及肝臟病理切片觀察肝臟炎癥損傷;結(jié)果polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射后,與野生型小鼠相比,Rag1-/-小鼠血清ALT活性在18和24小時明顯增高(P<0.01),而在12和48小時兩者沒有明顯區(qū)別(P>0.05)。肝臟HE染色結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比Rag1-/-小鼠在18和24小時有更嚴重的肝臟充血,炎癥細胞浸潤和肝細胞壞死,而在注射后

6、12小時兩者肝臟損傷無明顯差別,到了注射后48小時野生型小鼠肝臟損傷基本愈合,Rag1-/-小鼠肝臟仍有輕微充血。Rag1-/-小鼠肝臟炎性因子IFN-γmRNA表達在12,18,24和48小時顯著增強,明顯高于WT小鼠(P<0.05)。而TNF-αmRNA水平兩者無明顯差別(P>0.05)。Rag1-/-小鼠血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平在18,24和48小時顯著增強,明顯高于野生型小鼠(P<0.05),12小時兩者無明顯差別(P

7、>0.05)。用抗-CD25抗體清除小鼠調(diào)節(jié)性T之后,FCM檢測小鼠肝臟調(diào)節(jié)性T細胞的比例由18.62％下降為7.73%。清除鼠和野生型小鼠在polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射后,與野生型小鼠相比,清除鼠肝臟HE染色結(jié)果顯示,18和24小時有更嚴重的肝臟充血,炎癥細胞浸潤和肝細胞壞死,到了注射后48小時野生型小鼠肝臟損傷基本愈合而清除鼠肝臟仍可見充血。清除鼠血清ALT活性在18和24小時明顯高于野生型小鼠(P<0.01),在12和48

8、小時兩者血清ALT的水平未見明顯差別(P>0.05)。清除鼠肝臟炎性因子IFN-γ和TNF-αmRNA表達在18,24和48小時顯著增強,明顯高于野生型小鼠(P<0.05),血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平在18,24和48小時顯著增強,明顯高于WT小鼠(P<0.05)。同樣在注射后12小時清除鼠和野生型小鼠炎性因子IFN-γ和TNF-αmRNA水平和蛋白水平均無明顯差別(P>0.05)。跟過繼轉(zhuǎn)輸CD25-細胞以及未轉(zhuǎn)輸細胞的Rag

9、1-/-小鼠相比,過繼轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細胞的Rag1-/-小鼠在polyI:C/D-GalN注射后血清ALT活性明顯降低(P<0.05),肝臟HE染色結(jié)果也顯示肝臟充血和肝細胞壞死明顯減輕。
　　結(jié)論：在polyI:C/D-GalN誘發(fā)的爆發(fā)性肝炎模型中,與野生型小鼠相比,缺失調(diào)節(jié)性T細胞的Rag1-/-小鼠肝臟炎癥損傷更重,炎性因子的表達升高。清除調(diào)節(jié)性T細胞之后,與野生型小鼠相比清除鼠的肝臟炎癥損傷也加重,炎性因子的表達同樣升高。