靈芝多糖對LA795肺癌細胞分泌VEGF、TGF-β1、IL-10的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是一種高度惡性的腫瘤,其發(fā)病率高,預后差,嚴重威脅人類健康和生命。近年來,許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均顯著提高。肺癌的治療包括手術治療,放射治療,化學治療和免疫治療,其中手術治療是公認的早期肺癌治療的首選方法,在失去手術機會的肺癌病人中化療是其主要治療方法(超過90％的肺癌需要化療治療),近來免疫治療也進展迅速并進入臨床應用。
　　有研究表明,在肺癌細胞培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉化生長

2、因子-β1(TGF-β1)、白細胞介素-10(IL-10)等免疫抑制分子水平增高。腫瘤細胞分泌免疫抑制分子抑制機體免疫功能,是腫瘤細胞免疫逃逸并使得腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展和轉移的重要機制。我們是否可通過某些物質拮抗腫瘤細胞分泌免疫抑制分子,從而達到治療腫瘤的目的值得研究。
　　靈芝是我國傳統(tǒng)中藥,有2000多年的用藥歷史?，F(xiàn)代研究表明靈芝多糖(ganoderma lucidum polysaeeharides,Gl-PS)是靈芝的主要

3、活性成分之一,可作用于免疫系統(tǒng),提高免疫功能,從而發(fā)揮抗腫瘤作用;亦有少數(shù)實驗顯示靈芝多糖可直接抑制腫瘤細胞;而通過拮抗腫瘤產(chǎn)生免疫抑制物得以發(fā)揮抗腫瘤的作用機制尚未完全闡明。有實驗表明,靈芝多糖可拮抗B16F10黑色素瘤細胞分泌免疫抑制分子,但靈芝多糖是否具有拮抗其他腫瘤細胞分泌免疫抑制分子的作用尚需進一步確定。本實驗選用LA795肺癌細胞,探討靈芝多糖對這種腫瘤細胞分泌免疫抑制分子的影響,拓展對靈芝多糖抗腫瘤機制的認識,為肺癌的免疫

4、治療提供新思路。
　　方法:
　　1.細胞來源:本實驗采用的LA795細胞是一種來源于小鼠的肺腺癌細胞系。
　　2.實驗分組及干預:實驗依據(jù)培養(yǎng)LA795肺癌細胞的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中所含靈芝多糖濃度不同進行分組,設0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml五個實驗組,以完全培養(yǎng)基為空白對照。
　　3.采用免疫 ELISA方法,檢測各組細胞 VEGF、TGF-β1、IL-1

5、0因子的表達情況。
　　4.采用RT-qPCR技術,檢測各組細胞VEGF、TGF-β1、IL-10在基因轉錄水平的表達差異。
　　5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:應用 SPSS17.0統(tǒng)計學軟件,對結果進行單因素方差分析,p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.從表達量和基因水平檢測靈芝多糖對LA795肺腺癌細胞分泌VEGF的影響:在不同濃度靈芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg

6、/ml、12.8μg/ml)作用下,各組LA795肺癌細胞連續(xù)培養(yǎng)48h,應用ELISA技術檢測顯示,LA795肺癌細胞培養(yǎng)上清中 VEGF表達水平分別為147.98±0.28、120.25±14.24、103.11±10.57、91.27±13.62、84.66±10.41,以空白對照組的VEGF的表達水平最高,隨靈芝多糖濃度的不斷增高,LA795肺癌細胞VEGF表達水平逐漸降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=15.912,P<

7、0.005)。0μg/ml組與0.2μg/ml組、0.8μg/ml組、3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異均有顯著性(P<0.05)。應用RT-qPCR技術檢測顯示,LA795肺癌細胞 VEGF mRNA的表達水平分別為1.00±0.00、0.67±0.24、0.68±0.24、0.48±0.21、0.50±0.23,以空白對照組的VEGF mRNA的表達水平最高,應用靈芝多糖濃度后,LA795肺癌細胞 VEGF mR

8、NA表達水平降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=3.034,P<0.1)。0μg/ml組與3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異有顯著性(P<0.05)。結果顯示靈芝多糖可抑制LA795肺癌細胞VEGF基因轉錄。
　　2.從表達量和基因水平檢測靈芝多糖對 LA795肺癌細胞分泌 TGF-β1的影響:在不同濃度靈芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml)作用

9、下,各組LA795肺癌細胞連續(xù)培養(yǎng)48h,應用ELISA技術檢測顯示,LA795肺癌細胞培養(yǎng)上清中 TGF-β1表達水平分別為98.78±12.02、87.01±5.97、71.98±8.54、58.96±13.24、54.08±14.84,以空白對照組的TGF-β1的表達水平最高,隨靈芝多糖濃度的不斷增高,LA795肺癌細胞TGF-β1表達水平逐漸降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=8.152,P<0.005)。0μg/ml組與

10、3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異有顯著性(P<0.05)。應用 RT-qPCR技術檢測顯示,LA795肺癌細胞 TGF-β1 mRNA的表達水平分別為1.00±0.00、1.24±0.25、0.84±0.22、0.56±0.15、0.46±0.06以空白對照組和0.2μg/ml組的TGF-β1 mRNA的表達水平最高(二組之間差異無統(tǒng)計學意義,P>0.005),隨靈芝多糖濃度的不斷增高,LA795肺癌細胞TGF-β

11、1 mRNA表達水平逐漸降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=11.145,P<0.005)。0μg/ml組與3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異有顯著性(P<0.05)。結果顯示靈芝多糖可抑制LA795肺癌細胞TGF-β1基因轉錄。
　　3.從表達量和基因水平檢測靈芝多糖對 LA795肺癌細胞分泌 IL-10的影響:在不同濃度靈芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12

12、.8μg/ml)作用下,各組LA795肺癌細胞連續(xù)培養(yǎng)48h,應用ELISA技術檢測顯示,LA795肺癌細胞培養(yǎng)上清中 IL-10表達水平分別為57.04±3.45、46.53±4.23、41.54±1.59、41.54±4.21、36.49±0.80,以空白對照組的IL-10的表達水平最高,應用靈芝多糖濃度后,LA795肺癌細胞IL-10表達水平降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=17.975,P<0.001)。0μg/ml組與

13、0.2μg/ml組、0.8μg/ml組、3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異均有顯著性(p<0.05)。應用 RT-qPCR技術檢測顯示,LA795肺癌細胞IL-10 mRNA的表達水平分別為1.00±0.00、0.98±0.09、0.64±0.17、0.36±0.10、0.39±0.10,空白對照組的IL-10 mRNA的表達水平最高,應用靈芝多糖后,LA795肺癌細胞IL-10 mRNA表達水平降低。經(jīng)單因素方差分

14、析,差異有顯著性(F=24.319,P<0.001)。0μg/ml組與0.8μg/ml組、3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異均有顯著性(P<0.05)。結果顯示靈芝多糖可抑制LA795肺癌細胞IL-10基因轉錄。
　　結論:
　　1.LA795肺癌細胞可分泌免疫抑制分子VEGF、TGF-β1、IL-10。
　　2.靈芝多糖可下調(diào) LA795肺癌細胞分泌免疫抑制分子VEGF、TGF-β1、IL-10。