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1、目的:國(guó)內(nèi)外研究及本課題前期實(shí)驗(yàn)均證實(shí)腫瘤耐藥性的產(chǎn)生與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)之間具有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)以EMT主要調(diào)控因子——轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)為切入點(diǎn),探討TGF-β1小干擾RNA(Small interfering RNA, siRNA)對(duì)A549順鉑耐藥細(xì)胞(A549/DDP)耐藥性的影響,進(jìn)一步了解肺癌細(xì)胞順鉑耐藥性的發(fā)生機(jī)制,并從EMT的角
2、度尋找耐藥性腫瘤治療的新思路。
方法:設(shè)計(jì)TGF-β1 siRNA基因片段,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞,采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)觀察轉(zhuǎn)染前后A549/DDP細(xì)胞EMT表型標(biāo)記物E-cadherin、vimentin以及耐藥蛋白ERCC1mRNA及蛋白表達(dá)情況,CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞再次添加順鉑后增殖活性變化及化療藥物的敏感性變化。
結(jié)果:
1.與A549細(xì)胞相比,A549/DDP細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形
3、、排列呈旋渦狀或放射狀,類似纖維細(xì)胞;免疫細(xì)胞化學(xué)顯示細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E—cadherin表達(dá)下調(diào),間質(zhì)標(biāo)志物vimentin表達(dá)上調(diào),這些都與EMT發(fā)生時(shí)的典型特征相符合。
2.TGF-β1 siRNA轉(zhuǎn)染后,RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)均觀察到A549/DDP細(xì)胞E-cadherin表達(dá)增強(qiáng),vimentin表達(dá)下調(diào),并且耐藥因子ERCC1 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)。
3.CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞耐藥指數(shù)及再次添加順
4、鉑后的生長(zhǎng)活性變化,結(jié)果顯示A549/DDP細(xì)胞耐藥指數(shù)2.77,而A549/A549/DDP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞耐藥指數(shù)1.28,兩組具有顯著差異性(P=0.000);且A549/DDP轉(zhuǎn)染組與A549/DDP細(xì)胞相比,在添加順鉑24h、48h及72h后抑制率均明顯升高(P=0.000),而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組未見明顯差異(P>0.05)。
結(jié)論:
1.A549/DDP細(xì)胞在獲得耐藥性的同時(shí)呈現(xiàn)EMT,TGF-β1 siRNA轉(zhuǎn)染
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