牛傳染性鼻氣管炎TK-gE基因缺失重組病毒的研究.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis,IBR)，是由牛皰疹病毒1型(BHV-1)引起的一種牛的急性、熱性、接觸性傳染病，主要引起呼吸道和生殖道疾病，如傳染性鼻氣管炎、眼結(jié)膜炎、高熱、傳染性膿皰性外陰道炎、流產(chǎn)等。自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該病就在世界范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBR被國(guó)際獸疫局(OIE)列為B類疾病，該病的根治方法是陽(yáng)性牛檢出與捕殺，而防制的主要措施是接種疫苗，主要采用基因工

2、程疫苗的方法，國(guó)外也已相繼開(kāi)發(fā)出了牛皰疹病毒1型TK、gE基因缺失重組疫苗。
　　 BHV-1是有囊膜的雙股DNA病毒，其基因組G+C含量為72％，大小約為138kb,由一個(gè)UL區(qū)(106kb)和一個(gè)US區(qū)(10kb)及US區(qū)兩側(cè)的重復(fù)序列(IRs和TRs，各11kb，序列相同但方向相反)組成。BHV-1基因組編碼70個(gè)左右基因，其中有10種為糖蛋白。其中g(shù)E糖蛋白是病毒囊膜上的主要糖蛋白。它以細(xì)胞特異的方式影響病毒從被感染細(xì)胞

3、中釋放，同時(shí)gE基因的缺失也影響到病毒在細(xì)胞間的傳播。而胸腺激酶(TK)基因是牛皰疹病毒1型增殖的非必需基因，也是主要毒力基因之一，對(duì)病毒在神經(jīng)組織的持續(xù)感染具有非常重要的作用。
　　 本研究構(gòu)建了牛皰疹病毒1型TK/gE雙基因缺失突變株，并做了動(dòng)物安全性和保護(hù)力試驗(yàn)，為研究缺失標(biāo)志活病毒疫苗及研制表達(dá)外源基因的BHV-1重組病毒活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。主要工作包括：
　　 1.牛傳染性鼻氣管炎TK-/gE-基因雙缺失突變株

4、的構(gòu)建1)牛傳染性鼻氣管炎TK-/EGFP+突變株的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)以牛皰疹病毒1型全序列（基因登錄號(hào)為AJ004801）為基礎(chǔ)，提取病毒全基因組。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增TK基因上游和下游約1.0kb和1.1kb的片段作為同源重組臂，分別克隆于載體pBluescriptⅡSK(+)中。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將下游同源臂回收，定向插入到上游的克隆載體中，構(gòu)建中間轉(zhuǎn)移載體，并命名為pZF08-21。然后插入帶有完整啟動(dòng)子的EGFP報(bào)告

5、基因，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，并命名為pZF07-16。以磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將經(jīng)線性化的pZF07-16、質(zhì)粒pBICP0與BHV-1基因組DNA在牛腎細(xì)胞(MDBK)上共轉(zhuǎn)染，成功地進(jìn)行了同源重組，7輪篩選和純化獲得了BHV-1TK-/EGFP+突變株。
　　 2)牛傳染性鼻氣管炎TK-突變株的構(gòu)建提取BHV-1TK-/EGFP+突變株基因組，再次以磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將經(jīng)線性化的pZF08-21、質(zhì)粒pBICP0與基因組DNA在MDBK上共轉(zhuǎn)

6、染，同源重組去掉EGFP熒光標(biāo)簽，經(jīng)5輪純化成功的獲得了BHV-1TK-突變株。
　　 3)牛傳染性鼻氣管炎TK-/gE-/EGFP+雙缺失突變株的構(gòu)建方法同1，用PCR擴(kuò)增gE基因上游和下游約1.0kb和1.1kb的片段，分別克隆于載體pcDNA3.1(+)myc-HisB中。通過(guò)限制性酶切將上游同源臂回收，插入到下游的克隆載體中，構(gòu)建中間轉(zhuǎn)移載體，并命名為pZF09-08。然后插入EGFP報(bào)告基因，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，并命名

7、為pZF09-15。以磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將經(jīng)線性化的pZF09-15、質(zhì)粒pBICP0與BHV-1TK-缺失突變株基因組DNA在MDBK細(xì)胞上共轉(zhuǎn)染，成功地進(jìn)行同源重組，經(jīng)過(guò)7輪篩選和純化獲得了BHV-1TK-/gE-/EGFP+突變株。
　　 2.牛傳染性鼻氣管炎TK-/gE-/EGFP+雙缺失突變株的安全性和保護(hù)力研究1)牛傳染性鼻氣管炎TK-/gE-/EGFP+雙缺失突變株對(duì)牛的安全性研究安全性研究包括三部分：接種試驗(yàn)、同居試驗(yàn)

8、、再激活試驗(yàn)。接種試驗(yàn)和同居試驗(yàn)：將試驗(yàn)組按劑量分為105，106,107三欄，滴鼻免疫4X105、4X106、4X107PFU的雙缺失突變株，另設(shè)空白對(duì)照組。另在各欄中同時(shí)喂養(yǎng)未接種的牛作為同居對(duì)照。測(cè)量試驗(yàn)牛的體溫，觀察精神狀態(tài)和采食情況，采集檢測(cè)樣品。再激活試驗(yàn)：接種免疫28天后，連續(xù)3天以15mg/頭的劑量肌肉注射地塞米松，以激活處于潛伏感染狀態(tài)的病毒。試驗(yàn)證實(shí)了牛傳染性鼻氣管炎TK-/gE-/EGFP+雙缺失突變株具有很高的安

9、全性。
　　 2)牛傳染性鼻氣管炎TK-/gE-/EGFP+雙缺失突變株對(duì)牛的保護(hù)力研究?jī)稍慢g牛分別用4X105、4X106、4X107PFU的雙缺失突變株免疫4周后，以4X107PFUBHV-1強(qiáng)毒攻擊。同時(shí)設(shè)免疫DMEM的空白對(duì)照組。分別于攻毒后1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d和28d測(cè)量體溫、采集檢測(cè)樣品。試驗(yàn)結(jié)果表明：牛傳染性鼻氣管炎TK-/gE-/EGFP+雙缺失突變株對(duì)牛具有很強(qiáng)的保護(hù)力。