葡萄胎發(fā)病相關基因F10表達及功能的初步研究.pdf

1、葡萄胎(hydatidiformmole，HM)，是一組與妊娠有關的良性妊娠滋養(yǎng)細胞疾病，在我國的平均發(fā)病率為約1/1000。葡萄胎具有潛在的惡性，可轉變?yōu)榍治g性葡萄胎和絨毛膜癌。葡萄胎的發(fā)生及惡性轉化機制至今尚未完全清楚，除與其細胞遺傳學特性有關外，一些癌基因的激活和抑癌基因的失活可能參與了其發(fā)生、發(fā)展的過程這一觀點近年來受到關注。 研究前期通過抑制性消減雜交技術，獲得了正常早孕絨毛膜組織與葡萄胎組織之間的消減cDNA文庫，并

2、從中分離出一個在葡萄胎中高表達的新基因，暫按照工作序列號命名為F10。該課題通過原位雜交、熒光定量PCR技術及以基因沉默為基礎的RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術對F10的表達特性和功能進行了初步研究。 該研究包括以下三個部分： 第1章 F10基因在滋養(yǎng)細胞疾病及其它腫瘤組織中的原位雜交檢測 1.1 研究內容與研究方法 選定的12例早孕絨毛組織、12例葡萄胎、6例侵襲性葡萄胎、8例

3、絨癌、7例子宮內膜、6例宮頸上皮癌、9例卵巢腺癌、6例子宮內膜癌、8例乳腺癌、8例肝癌、6例胃癌切片均經HE染色后病理確診。在首先制備地高辛標記的F10基因RNA探針的基礎上，采用原位雜交的方法檢測組織中F10基因mRNA的表達水平。 1.2 結果 1.2.1 F10基因在12例早孕絨毛組織滋養(yǎng)細胞均無陽性雜交信號。12例葡萄胎滋養(yǎng)細胞胞漿中全部呈陽性表達，其中10例為中等強度陽性表達，1例為強陽性、1例為弱陽性表達。

4、 1.2.2 侵蝕性葡萄胎中侵入肌層的滋養(yǎng)細胞胞漿顯示F10基因的表達，6例均為陽性，其中強陽性表達占33.3％；8例絨癌標本中，來源于滋養(yǎng)細胞的絨癌細胞胞漿均呈現深染的藍紫色信號，其中強陽性表達占75％。 1.2.3 葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨癌組織標本中F10基因陽性表達水平的遞增趨勢(P＜0.05)，一定程度反映F10基因與滋養(yǎng)細胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。 1.2.4 在卵巢腺癌、子宮內膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌中

5、，F10基因全部呈陽性表達，其中多為中等強度陽性。子宮內膜、宮頸上皮及肝癌癌旁正常組織中沒有發(fā)現有陽性信號。表明F10基因除了與葡萄胎發(fā)病相關外，還參與其他腫瘤如卵巢腺癌、子宮內膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌的形成。而正常組織中不表達F10基因。 第2章 實時定量PCR分析F10基因在正常妊娠滋養(yǎng)細胞與葡萄胎及其他腫瘤組織中的表達 2.1 研究內容與研究方法 采用熒光定量PCR對早孕絨毛、中期及晚期胎盤與葡萄胎組織中F

6、10基因的表達進行了檢測，同時提取了正常肝臟、脾臟組織與子宮內膜癌、直腸癌及肝癌癌旁新鮮組織的總RNA，應用實時定量PCR技術進一步確認這些組織中F10基因的表達及差異。 2.2 結果 2.2.1 葡萄胎中F10基因的拷貝數高出早孕絨毛、中期及晚期胎盤中F10基因拷貝數的10-100倍，顯示出葡萄胎中F10基因顯著的高表達。 2.2.2 正常肝臟、脾臟組織中F10表達拷貝數分別為26、30，與正常絨毛及中、晚期胎

7、盤中水平相當。子宮內膜癌、肝癌及直腸癌中F10基因拷貝數分別為167、159、145，表達水半雖然沒有葡萄胎中的高，但高出正常肝臟、脾臟組織的4-6倍。 2.2.3 4例肝癌癌旁組織中F10基因的標化拷貝數從3.6到27.8不等，8例肝癌組織中有6例(75％)顯示出F10基因的過表達，其F10基因的標化拷貝數全部高出肝癌癌旁組織最高拷貝數量的1.5倍，其中兩例達到5.7和4.9倍，提示在原發(fā)性肝癌中F10較高的表達水平具有普遍性

8、。 第3章 F10基因沉默對絨癌細胞增殖和凋亡的影響 3.1 研究內容與研究方法 通過體外轉錄的方法制備出針對F10基因的小分子雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)，轉染KLE細胞后，經熒光定量PCR檢測確定F10基因有效沉默，進一步采用MTT法繪制KLE細胞生長曲線觀察F10基因沉默對KLE細胞生長的影響，同時應用流式細胞儀檢測F10基因沉默對KLE細胞凋亡的影響。 3.2 結

9、果 3.2.1 生長曲線反映對照組細胞24小時出現了細胞數減少，隨后很快恢復增殖，接種后第4天細胞數就增加到接種后第1天的2倍。轉染F10基因dsRNA24小時后，KLE細胞數也顯著減少(只有接種細胞數的1/3)，并且一直到接種后72小時細胞數量都處于較低水平，直到第4天細胞才開始緩慢增殖，但增殖速度(生長曲線的斜率)明顯慢于對照組。因此，F10基因的沉默對KLE細胞的增殖有明顯的抑制作用。 3.2.2 流式細胞儀檢測發(fā)

10、現，轉染24小時后，實驗組和對照組細胞凋亡率分別為15％和4.1％，實驗組的凋亡率明顯升高，為對照組的3.7倍(P＜0.05)。48小時后對照組的凋亡率達到20.3％，為對照組凋亡率(4.9％)的4.14倍，兩者之間也存在顯著的差異(P＜0.05)。比較細胞凋亡升高的比率，24小時和48小時之間沒有明顯差別(P＞0.05)，表明基因沉默后1-2天內，凋亡以穩(wěn)定的機制持續(xù)作用。 結論 1.通過原位雜交和熒光定量PCR技術，

11、對葡萄胎組織中F10基因的表達進行了檢測，明確了F10基因是其來源組織葡萄胎中的高表達基因。 2.同時發(fā)現F10基因在滋養(yǎng)細胞疾病均為陽性表達。在葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨癌中的表達強度遞增，提示F10可能與滋養(yǎng)細胞疾病發(fā)生及侵襲行為相關。 3.F10基因在卵巢腺癌、子宮內膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌也顯示出陽性表達，提示F10基因還可能參與其他腫瘤的發(fā)生。 4.RNA干擾體外實驗證實F10基因沉默后，KLE細胞出現了