葡萄胎發(fā)病相關(guān)基因F10表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、葡萄胎(hydatidiformmole，HM)，是一組與妊娠有關(guān)的良性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病，在我國(guó)的平均發(fā)病率為約1/1000。葡萄胎具有潛在的惡性，可轉(zhuǎn)變?yōu)榍治g性葡萄胎和絨毛膜癌。葡萄胎的發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制至今尚未完全清楚，除與其細(xì)胞遺傳學(xué)特性有關(guān)外，一些癌基因的激活和抑癌基因的失活可能參與了其發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程這一觀點(diǎn)近年來(lái)受到關(guān)注。 研究前期通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)，獲得了正常早孕絨毛膜組織與葡萄胎組織之間的消減cDNA文庫(kù)，并

2、從中分離出一個(gè)在葡萄胎中高表達(dá)的新基因，暫按照工作序列號(hào)命名為F10。該課題通過(guò)原位雜交、熒光定量PCR技術(shù)及以基因沉默為基礎(chǔ)的RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)對(duì)F10的表達(dá)特性和功能進(jìn)行了初步研究。 該研究包括以下三個(gè)部分： 第1章 F10基因在滋養(yǎng)細(xì)胞疾病及其它腫瘤組織中的原位雜交檢測(cè) 1.1 研究?jī)?nèi)容與研究方法 選定的12例早孕絨毛組織、12例葡萄胎、6例侵襲性葡萄胎、8例

3、絨癌、7例子宮內(nèi)膜、6例宮頸上皮癌、9例卵巢腺癌、6例子宮內(nèi)膜癌、8例乳腺癌、8例肝癌、6例胃癌切片均經(jīng)HE染色后病理確診。在首先制備地高辛標(biāo)記的F10基因RNA探針的基礎(chǔ)上，采用原位雜交的方法檢測(cè)組織中F10基因mRNA的表達(dá)水平。 1.2 結(jié)果 1.2.1 F10基因在12例早孕絨毛組織滋養(yǎng)細(xì)胞均無(wú)陽(yáng)性雜交信號(hào)。12例葡萄胎滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿中全部呈陽(yáng)性表達(dá)，其中10例為中等強(qiáng)度陽(yáng)性表達(dá)，1例為強(qiáng)陽(yáng)性、1例為弱陽(yáng)性表達(dá)。

4、 1.2.2 侵蝕性葡萄胎中侵入肌層的滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿顯示F10基因的表達(dá)，6例均為陽(yáng)性，其中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)占33.3％；8例絨癌標(biāo)本中，來(lái)源于滋養(yǎng)細(xì)胞的絨癌細(xì)胞胞漿均呈現(xiàn)深染的藍(lán)紫色信號(hào)，其中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)占75％。 1.2.3 葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨癌組織標(biāo)本中F10基因陽(yáng)性表達(dá)水平的遞增趨勢(shì)(P＜0.05)，一定程度反映F10基因與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。 1.2.4 在卵巢腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌中

5、，F(xiàn)10基因全部呈陽(yáng)性表達(dá)，其中多為中等強(qiáng)度陽(yáng)性。子宮內(nèi)膜、宮頸上皮及肝癌癌旁正常組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有陽(yáng)性信號(hào)。表明F10基因除了與葡萄胎發(fā)病相關(guān)外，還參與其他腫瘤如卵巢腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌的形成。而正常組織中不表達(dá)F10基因。 第2章 實(shí)時(shí)定量PCR分析F10基因在正常妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞與葡萄胎及其他腫瘤組織中的表達(dá) 2.1 研究?jī)?nèi)容與研究方法 采用熒光定量PCR對(duì)早孕絨毛、中期及晚期胎盤(pán)與葡萄胎組織中F

6、10基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)提取了正常肝臟、脾臟組織與子宮內(nèi)膜癌、直腸癌及肝癌癌旁新鮮組織的總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)這些組織中F10基因的表達(dá)及差異。 2.2 結(jié)果 2.2.1 葡萄胎中F10基因的拷貝數(shù)高出早孕絨毛、中期及晚期胎盤(pán)中F10基因拷貝數(shù)的10-100倍，顯示出葡萄胎中F10基因顯著的高表達(dá)。 2.2.2 正常肝臟、脾臟組織中F10表達(dá)拷貝數(shù)分別為26、30，與正常絨毛及中、晚期胎

7、盤(pán)中水平相當(dāng)。子宮內(nèi)膜癌、肝癌及直腸癌中F10基因拷貝數(shù)分別為167、159、145，表達(dá)水半雖然沒(méi)有葡萄胎中的高，但高出正常肝臟、脾臟組織的4-6倍。 2.2.3 4例肝癌癌旁組織中F10基因的標(biāo)化拷貝數(shù)從3.6到27.8不等，8例肝癌組織中有6例(75％)顯示出F10基因的過(guò)表達(dá)，其F10基因的標(biāo)化拷貝數(shù)全部高出肝癌癌旁組織最高拷貝數(shù)量的1.5倍，其中兩例達(dá)到5.7和4.9倍，提示在原發(fā)性肝癌中F10較高的表達(dá)水平具有普遍性

8、。 第3章 F10基因沉默對(duì)絨癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 3.1 研究?jī)?nèi)容與研究方法 通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的方法制備出針對(duì)F10基因的小分子雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)，轉(zhuǎn)染KLE細(xì)胞后，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)確定F10基因有效沉默，進(jìn)一步采用MTT法繪制KLE細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察F10基因沉默對(duì)KLE細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)F10基因沉默對(duì)KLE細(xì)胞凋亡的影響。 3.2 結(jié)

9、果 3.2.1 生長(zhǎng)曲線反映對(duì)照組細(xì)胞24小時(shí)出現(xiàn)了細(xì)胞數(shù)減少，隨后很快恢復(fù)增殖，接種后第4天細(xì)胞數(shù)就增加到接種后第1天的2倍。轉(zhuǎn)染F10基因dsRNA24小時(shí)后，KLE細(xì)胞數(shù)也顯著減少(只有接種細(xì)胞數(shù)的1/3)，并且一直到接種后72小時(shí)細(xì)胞數(shù)量都處于較低水平，直到第4天細(xì)胞才開(kāi)始緩慢增殖，但增殖速度(生長(zhǎng)曲線的斜率)明顯慢于對(duì)照組。因此，F(xiàn)10基因的沉默對(duì)KLE細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。 3.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)

10、現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為15％和4.1％，實(shí)驗(yàn)組的凋亡率明顯升高，為對(duì)照組的3.7倍(P＜0.05)。48小時(shí)后對(duì)照組的凋亡率達(dá)到20.3％，為對(duì)照組凋亡率(4.9％)的4.14倍，兩者之間也存在顯著的差異(P＜0.05)。比較細(xì)胞凋亡升高的比率，24小時(shí)和48小時(shí)之間沒(méi)有明顯差別(P＞0.05)，表明基因沉默后1-2天內(nèi)，凋亡以穩(wěn)定的機(jī)制持續(xù)作用。 結(jié)論 1.通過(guò)原位雜交和熒光定量PCR技術(shù)，

11、對(duì)葡萄胎組織中F10基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，明確了F10基因是其來(lái)源組織葡萄胎中的高表達(dá)基因。 2.同時(shí)發(fā)現(xiàn)F10基因在滋養(yǎng)細(xì)胞疾病均為陽(yáng)性表達(dá)。在葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨癌中的表達(dá)強(qiáng)度遞增，提示F10可能與滋養(yǎng)細(xì)胞疾病發(fā)生及侵襲行為相關(guān)。 3.F10基因在卵巢腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌也顯示出陽(yáng)性表達(dá)，提示F10基因還可能參與其他腫瘤的發(fā)生。 4.RNA干擾體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)F10基因沉默后，KLE細(xì)胞出現(xiàn)了