葡萄胎高表達的F10基因功能初步研究.pdf

1、葡萄胎是一種與妊娠有關(guān)的良性病變，發(fā)病率為1／100-1／500，部分葡萄胎可發(fā)展為侵蝕性葡萄胎，再進一步發(fā)展成絨癌。因此葡萄胎仍是一種嚴重危害育齡婦女生育健康及身心健康的重要疾病。葡萄胎的發(fā)生與惡性轉(zhuǎn)化機制仍不明確， 目前有如下幾方面的學說： 1、流行病學調(diào)查結(jié)果表明文化因素和葡萄胎的發(fā)生有統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)。提示較高的文化程度可以降低葡萄胎發(fā)病的可能性。 2、葡萄胎的遺傳學說：葡萄胎的發(fā)生多是異常受精所致。

2、3、研究結(jié)果顯示妊娠次數(shù)與葡萄胎的發(fā)病也是有相關(guān)關(guān)系，較多的妊娠次數(shù)可能是葡萄胎發(fā)病的一種危險因素。 4、另外多次接受刮、吸宮術(shù)也是葡萄胎發(fā)生的一項重要危險因素。 5、癌基因及腫瘤抑制基因和凋亡調(diào)節(jié)基因也參與葡萄胎的發(fā)生。 而目前的大量研究提示葡萄胎的基因組中可能存在遺傳易感基因，迄今為止國內(nèi)外還未獲得葡萄胎的遺傳易感基因。為明確葡萄胎的基因?qū)W發(fā)病機制，前期我們從基因克隆方面入手，在早孕的絨毛組織和正常的葡萄胎組

3、織進行抑制性消減雜交，分離和鑒定出一種功能未明的在葡萄胎中高表達的基因F10，F(xiàn)10是一個新基因從未在任何組織或疾病中有過研究報道。 第一部分：F10基因轉(zhuǎn)染細胞表達譜分析 F10基因是我們在探討葡萄胎發(fā)病機理時發(fā)現(xiàn)的未知功能的新基因。 方法： 1、F10低表達細胞株的篩選：選取Be17402、HIC、HepG2、PC、A549、MGC、16HBE、293八種細胞，利用細胞免疫組化技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)

4、篩選出F10低表達的細胞株； 2、F10基因轉(zhuǎn)染其低表達的細胞株后觀察其基因表達譜的變化：利用差異顯示技術(shù)粗篩F10基因?qū)毎虮磉_譜的影響，實驗分四組：質(zhì)粒pRc-CMV2／F10+、pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-分別瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞組及空白細胞對照組。 結(jié)果： 1、熒光定量PCR、細胞免疫組化結(jié)果表明：新基因F10在人的8種細胞中呈不同程度的表達。其中F10基因在MGC、PC、Be1740

5、2中高表達，在HepG2、HIC中表達次之，在293中表達量較低，在16HBE、A549中表達量最低。 2、質(zhì)粒pRc-CMV2／F10+、pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-分別瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞組及空白細胞對照組四個實驗組間差異顯示的條帶擴增后測序獲得 小結(jié)： 1、利用細胞免疫組化技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)檢測到F10在Be17402、HIC、HepG2、PC、A549、MGC、16HBE、293八種

6、細胞中呈不同水平的表達。其中F10基因在MGC、PC、Be17402中高表達，在HepG2、HIC中表達次之，在293中表達量較低，在16HBE、A549中表達量最低。 2、利用差異顯示技術(shù)粗篩F10基因轉(zhuǎn)染對細胞基因表達譜的影響，獲得的各組之間有統(tǒng)計學意義差異表達的5個基因：annexinI、IPLA2、DATF1、STAT1、BASP1，根據(jù)差異表達基因的功能提示F10基因參與細胞的增殖和凋亡過程。 第二部分：F10

7、基因?qū)D(zhuǎn)錄因子活性影響 我們通過抑制性消減雜交和差異篩選法，克隆到一個新的在葡萄胎中表達上調(diào)的基因片斷：F10ESTcDNA(Genbank登陸號：AB196290)，利用細胞免疫組化和熒光定量PCR技術(shù)在Be17402、HIC、Hepc2、PC、A549、MGC、16HBE、293八種細胞中篩選出F10低表達的細胞株后利用差異顯示技術(shù)粗篩F10基因轉(zhuǎn)染對細胞基因表達譜的影響，根據(jù)獲得差異表達基因的功能，提示F10基因可能與細胞

8、的增殖和凋亡有關(guān)。 方法： 1、F10基因?qū)χ匾男盘杺鲗返挠绊懀嘿|(zhì)粒pRc-CMV2／F10+(pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-)和報道系統(tǒng)AP1-Luc(NF-κB-Luc、pHSE-luc、pCRE-luc、pSRE-luc、pGRE-luc)共轉(zhuǎn)染A549細胞，通過測定熒火蟲熒光素酶活性，利用熒光素酶報道系統(tǒng)分析F10對細胞重要傳導通路的作用。 2、EMSA實驗檢測AP1和NF-κB和DN

9、A的結(jié)合活性。 結(jié)果： 1、pRc-CMV2／F10+組、pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10-組細胞在F10和API-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24h即可檢測熒光素酶的活性，并逐漸增高至轉(zhuǎn)染后48h，pRc-CMV2／F10+組較pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10-組之間的熒光素酶活性高且差別有統(tǒng)計學意義，P=0.000。pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10-組熒光素酶活性無統(tǒng)計學意義，轉(zhuǎn)染72h后各組

10、熒光素酶活性開始下降，各組之間無統(tǒng)計學意義。 2、pRc-CMV2／F10+組、pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10-組細胞在F10和NF-κB-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24h即可檢測熒光素酶的活性，48小時達到最高，pRc-CMV2／F10+組較其它二組熒光素酶活性低且差別有統(tǒng)計學意義，P=0.000。 3、pRc-CMV2／F10+組、pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10一組細胞在F10分別和pHSE一1uc

11、、pCRE-luc、pSRE-luc、pGRE-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義。 小結(jié)： 1、利用質(zhì)粒pRc-CMV2／F10+(pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-)分別和報道系統(tǒng)AP1-Luc共轉(zhuǎn)染A549細胞，通過測定熒火蟲熒光素酶活性，利用熒光素酶報道系統(tǒng)分析F10對細胞重要傳導通路的作用。 第三部分：F10基因?qū)毎鲋澈图毎芷诘挠绊?綜合前二部分的研究，提示F10基

12、因參與促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的過程，導致細胞生長發(fā)育異常。 方法： 1、F10對細胞增殖的影響：轉(zhuǎn)染pRc-CMV2／F10和pRc-CMV2質(zhì)粒于肺癌細胞系A(chǔ)549，通過MTT實驗檢測二組細胞生長增殖情況； 2、F10對細胞周期的影響：轉(zhuǎn)染pRc-CMV2／F10和pRc-CMV2質(zhì)粒于肺癌細胞系A(chǔ)549，通過流式細胞技術(shù)檢測二組細胞各個細胞周期的變化情況； 3、利用免疫組化方法檢測上述二組細胞中增

13、殖核抗原(PCNA)和細胞周期素D1(cyclinD1)的表達變化。 結(jié)果： 1、根據(jù)酶標儀連續(xù)6天測定的570nm波長吸光值繪制出肺癌細胞A549的生長曲線，在保證培養(yǎng)條件、接種細胞量、觀察時間一致的情況下，二組細胞之間總體生長趨勢差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。pRc-CMV2／F10組其促進細胞增殖作用比對照組明顯。 2、流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果：pRc／CMV2／F10基因轉(zhuǎn)染細胞48小時較對照組細胞中G

14、2／M期細胞比例升高1.2倍、S期升高2.1倍。二組相比差異有顯著性意義，P<0.05。 3、免疫組化顯示：PCNA在A549／F10組細胞中強陽性表達，在A549／空載體組細胞中呈中度陽性表達。 小結(jié)： 1、轉(zhuǎn)染pRc-CMV2-F10和pRc-CMV2質(zhì)粒于肺癌細胞系A(chǔ)549，通過MTT實驗得出二組細胞連續(xù)6天的總體生長趨勢差異有顯著性意義(P=0.000)。pRc-CMV2／F10+組其促進細胞增殖作用較對

15、照組明顯。提示F10基因有促進細胞增殖的作用。 2、轉(zhuǎn)染pRc-CMV2-F10和pRc-CMV2質(zhì)粒于肺癌細胞系A(chǔ)549，采用流式細胞技術(shù)檢測F10對細胞生長周期的影響，pRc／cMV2／F10基因轉(zhuǎn)染細胞48小時較對照組細胞中G2／M期細胞比例升高1.2倍，S期升高2.1倍。 3、利用免疫組化方法檢測細胞中增殖核抗原(PCNA)和細胞周期素D1(eyelinD1)的表達變化。 第四部分：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染F10基因A5

16、49細胞株的構(gòu)建 研究探討基因的功能利用基因轉(zhuǎn)導技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入某一細胞，通過觀察細胞生物學行為的變化來認識基因的功能，這是目前使用最廣泛、技術(shù)最成熟的基因功能研究方法，而建立穩(wěn)定表達外源基因的細胞模型是這一研究不可或缺的關(guān)鍵一步。 方法： F10基因真核細胞穩(wěn)定表達系統(tǒng)構(gòu)建與鑒定： 1.質(zhì)粒pRc-CMV2／F10和pRc／CMV2提取、鑒定后轉(zhuǎn)染A549細胞系。用G418篩選并擴大培養(yǎng)，建立陽性單克

17、隆細胞株。 2.熒光定量PCR技術(shù)鑒定獲得的陽性克隆細胞株。 結(jié)果： 1.質(zhì)粒pRc-CMV2／F10、pRc-CMV2轉(zhuǎn)染A549細胞系后細胞經(jīng)過大約三個月的篩選，得到2株穩(wěn)定表達pRc／cMV2-F10基因的A549細胞和1株穩(wěn)定表達pRc／CMV2基因的A549細胞。 2.熒光定量PCR結(jié)果表明：pRc-CMV2／F10+細胞株F10表達水平較pRc-CMV2高，結(jié)果有統(tǒng)計學意義。P<0.05。