鼠傷寒沙門氏菌外排泵AcrAB失活對其它外排泵表達的影響.pdf

1、沙門氏菌是一類主要食源性病原菌，在沙門氏菌誘發(fā)感染病例中,鼠傷寒沙門氏菌占很高的分離率。氟喹諾酮類藥作為治療沙門氏菌病的首選藥物被廣泛用于臨床。在氟喹諾酮類選擇壓力下，鼠傷寒沙門氏菌很快對其產(chǎn)生耐藥，其中最主要的耐藥機制是增強的外排作用和拓撲異構(gòu)酶突變。
　　本實驗選取敏感的鼠傷寒沙門氏菌臨床株 SH10作為親本菌，建立了pKD46和噬菌體 P22介導(dǎo)的基因敲除的方法。為研究 AcrAB-TolC及其調(diào)控因子對 SH10敏感性的作

2、用，我們分別構(gòu)建了外排泵和調(diào)控因子的基因缺失株并采用二倍瓊脂稀釋法測定了缺失株的MIC。結(jié)果顯示，與原菌 SH10相比，這些缺失株對受試的15種抗生素的MIC值沒有發(fā)生明顯的變化，表明缺失acrAB及其調(diào)控因子沒有對 SH10的藥物敏感性產(chǎn)生顯著的影響。另外，我們在半固體培養(yǎng)基上測定了這些缺失株的遷移力。數(shù)據(jù)顯示，缺失 marA、ramA和 soxR后，細菌在培養(yǎng)基上移動的半徑由27 mm下降至18.3-21.7 mm（P<0.05或P

3、<0.01）；而缺失 marR、ramR和 soxS時，細菌的移動半徑由27 mm升高至31-33.7 mm（P<0.05)。缺失acrA或acrB時，細菌的移動半徑也增大，但變化不顯著；而缺失 tolC時，細菌的移動半徑減小。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子marA、ramA和soxR對鼠傷寒沙門氏菌SH10的遷移力起著正向調(diào)控的作用。
　　為研究鼠傷寒沙門氏菌耐多藥外排泵 AcrAB-TolC是否存在反饋調(diào)節(jié)機制，我們檢測了 SH1

4、0在加入外排泵抑制劑 PAβN后 acrAB-tolC各基因的表達情況，以及缺失 acrA或 acrB后剩余外排泵基因和調(diào)控因子的表達水平。熒光定量數(shù)據(jù)顯示，加入 PAβN后，acrA和 acrB的表達水平升高到原來的2.32倍和1.57倍，marA和 ramA的表達水平分別提高到原來的1.40倍和2.94倍。當缺失acrA時，acrB和 tolC的表達水平升高到原來的2.92倍和2.48倍，而 marA和ramA則分別升高到原來的2.

5、29倍和2.89倍。當缺失tolC時，acrA和acrB的表達升高了2.48倍和2.45倍，marA和ramA分別升高了3.03倍和3.07倍。因此，當沙門氏菌外排泵 AcrAB-TolC功能失活時，細菌會通過激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因ramA和marA反過來促進acrAB-tolC的表達。
　　為研究鼠傷寒沙門氏菌 SH10主要外排泵 acrAB與其余外排泵間的關(guān)系，我們量測定了?acrAB::kan缺失株中另外八種外排泵基因 acrF、

6、acrD、mdsB、mdtB、macA、emrA、mdfA和 mdtK的表達水平。除 mdtK外，其余的外排泵的表達水平均不同程度上調(diào)（1.59-2.26倍，P<0.05）。同樣地，我們還檢測了通過P22構(gòu)建的?acrABmarA::kan、?acrABramA::kan和?acrABsoxS::kan雙基因缺失株中另外八種外排泵的表達情況。結(jié)果顯示，缺失?acrAB::kan中的調(diào)控基因marA、ramA和 soxS，可使缺失株中其它

7、外排泵的表達水平顯著地降低（0.26-0.85倍、0.18-0.88倍和0.27-1.26倍，P<0.05）。另外，我們也檢測了?acrEF::kan、?acrD::kan、?mdtABC::kan、?mdsABC::kan、?macAB::kan、?emrAB::kan、?mdfA::kan和?mdtK::kan中 acrAB-tolC及其調(diào)控因子的表達情況。結(jié)果顯示，在這八株外排泵缺失株中，acrAB-tolC及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因 ma

8、rA和 ramA的表達水平都顯著的增加(P<0.05)，而且其遷移力也有所增強。以上結(jié)果表明，沙門氏菌SH10可以通過marA和ramA來實現(xiàn)acrAB與其它外排泵間的相互調(diào)節(jié)。
　　在環(huán)丙沙星的選擇壓力下，我們在體外篩選出鼠傷寒沙門氏菌臨床株SH10和標準株 SL1344的不同耐藥水平的誘導(dǎo)菌。其中 SH-1和 SL-1為敏感性降低株（MICcip為0.125μg/mL和0.25μg/mL），SH-2和 SL-2為低水平耐藥株（

9、MICcip均為2μg/mL），SH-3和SL-3為高水平耐藥菌（MICcip為8μg/mL）。QRDR突變檢測結(jié)果顯示，這些不同耐藥水平的誘導(dǎo)菌中，只在 GyrA的83位檢測到突變S83F。于是，我們又檢測了誘導(dǎo)菌中主要耐多藥泵acrAB-tolC及其主要的轉(zhuǎn)錄激活因子 ramA、marA和 soxS的表達情況。結(jié)果顯示，隨著耐藥水平的升高，外排泵的表達水平也不斷隨之升高(P<0.05)，并且是由 ramA介導(dǎo)的。MIC結(jié)果顯示，高水

10、平耐壓株 SH-3和 SL-3表現(xiàn)為多重耐藥。另外我們也檢測了這些誘導(dǎo)菌的適應(yīng)性，結(jié)果顯示隨著細菌耐藥性的增加，細菌的生長能力、細菌毒力和遷移力都呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。
　　結(jié)論：當鼠傷寒沙門氏菌 SH10耐多藥泵 acrAB功能失活時，細菌一方面可以通過全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子marA和ramA反饋性促進acrAB的表達；另一方面，細菌可以通過激活marA和ramA的表達來促進其它的外排泵的表達尤其是RND家族的外排泵，以補償細菌喪失