miR-127對肺癌進(jìn)展的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明miR-127參與肺癌的發(fā)生與發(fā)展；探明miR-127在肺癌中的重要調(diào)控功能；深入研究miR-127對于肺癌進(jìn)展的分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.分別用原位雜交和Real time PCR方法檢測人肺癌組織標(biāo)本和不同人肺癌細(xì)胞系中miR-127的表達(dá)；分別建立miR-127過表達(dá)的PC9細(xì)胞和miR-127敲減的A549穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并用Real time PCR方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

2、系中miR-127的變化水平。
　　2.Real time PCR和Western blot方法檢測PC9細(xì)胞過表達(dá)miR-127和A549細(xì)胞敲減miR-127后EM T相關(guān)的分子標(biāo)志物的表達(dá)差異。
　　3.體外轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測PC9細(xì)胞過表達(dá)miR-127和A549細(xì)胞敲減miR-127后，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化。
　　4.腫瘤干性實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測 PC9細(xì)胞過表達(dá) miR-127和A549細(xì)胞敲減m

3、iR-127后，腫瘤細(xì)胞的腫瘤干性與克隆形成率。MTS和Western blot方法檢測PC9細(xì)胞過表達(dá)miR-127和A549細(xì)胞敲減miR-127后，對于Gefitinib誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性的變化，及對于Gefitinib所引起AKT和ERK的磷酸化水平的改變。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測miR-127過表達(dá)的PC9細(xì)胞和miR-127敲減的A549細(xì)胞系與對照組相比的成瘤能力，用免疫組織化方法檢測Vimentin、Ki67、MMP9和TNF

4、AIP3在裸鼠腫瘤組織中的表達(dá)。
　　5.Real time PCR和Western blot方法檢測PC9細(xì)胞過表達(dá)miR-127和A549細(xì)胞敲減 miR-127前后，TNFAIP3的表達(dá)的變化；雙熒光素酶報告基因檢測 miR-127對TNFAIP3的直接靶向抑制作用。
　　6.Western blot的方法檢測PC9及A549細(xì)胞過表達(dá)及抑制miR-127前后，經(jīng)TNF-α作用后NF-κB信號通路相關(guān)蛋白IKKα/β、

5、IκBα及p65的磷酸化水平的變化及RIP1的K63泛素化水平的變化。
　　7.體外轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、MTS實(shí)驗(yàn)及 Western blot的方法檢測 TNFAIP3對miR-127調(diào)控肺癌過程的作用。
　　結(jié)果：
　　1.人肺癌組織與人肺癌細(xì)胞系中，miR-127異常高表達(dá)。
　　2.PC9細(xì)胞過表達(dá)miR-127后，上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-Cadherin顯著下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-Cadherin、ZEB1

6、和Vimentin顯著上調(diào)。A549細(xì)胞敲減 miR-127后，上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-Cadherin顯著上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-Cadherin、ZEB1和Vime nt in顯著下調(diào)。
　　3.PC9細(xì)胞過表達(dá)miR-127后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力顯著增加；而A549細(xì)胞敲減miR-127后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力顯著減弱。
　　4.miR-127促進(jìn) PC9細(xì)胞的腫瘤干性，同時促進(jìn)了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長；而敲減miR-12

7、7的A549細(xì)胞腫瘤干性減弱，體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞生長減緩。Gefitinib降低PC9和A549細(xì)胞的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。miR-127過表達(dá)的PC9細(xì)胞與對照組相比，對于Gefitinib誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性降低，同時上調(diào)了AKT與ERK的磷酸化水平；而敲減 miR-127后，A549細(xì)胞凋亡增加，AKT與ERK的磷酸化水平顯著下調(diào)。miR-127上調(diào) Vimentin、Ki67、MMP9等蛋白的表達(dá)，抑制TNFAIP3蛋

8、白的表達(dá)。
　　5.在穩(wěn)定過表達(dá)miR-127的PC9細(xì)胞系中，與對照組相比，TNFAIP3的表達(dá)明顯下調(diào)，在穩(wěn)定敲減miR-127的A549細(xì)胞系中，與對照組相比，TNFAIP3的表達(dá)明顯上調(diào)，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-127可直接靶向抑制TNFAIP3的3’-UTR序列。
　　6.PC9細(xì)胞過表達(dá)miR-127后，與對照組相比經(jīng) TNF-α作用后NF-κB信號通路中IKKα/β、IκBα及 p65的磷酸化水平明顯

9、上調(diào)，RIP1的K63泛素化水平增強(qiáng)；而A549細(xì)胞抑制 miR-127表達(dá)后，與對照組相比經(jīng)TNF-α作用后IKKα/β、IκBα及p65的磷酸化水平明顯下降，RIP1的K63泛素化水平減弱。在 miR-127過表達(dá)的PC9細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TNFAIP3真核表達(dá)載體后，miR-127所引起的NF-κB信號通路的變化有所回復(fù)。
　　7.在 miR-127過表達(dá)的PC9細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 TNFAIP3真核表達(dá)載體，可抑制細(xì)胞的EMT、轉(zhuǎn)移和侵襲

10、能力；miR-127過表達(dá)的PC9細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TNFAIP3真核表達(dá)載體，在 Gefitinib誘導(dǎo)下，miR-127對腫瘤細(xì)胞的抑制凋亡作用得到抑制，AKT與ERK的磷酸化水平有所回復(fù)。
　　結(jié)論：
　　1．肺癌組織中miR-127呈現(xiàn)顯著高表達(dá)。
　　2．miR-127促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、生長及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EM T）。
　　3．miR-127可降低肺癌細(xì)胞對于Gefitinib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。