人AB型血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)擴增人臍血源基質(zhì)細胞的實驗研究.pdf

1、造血微環(huán)境(Hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是造血干細胞產(chǎn)生、增殖和分化發(fā)育的場所，基質(zhì)細胞是造血微環(huán)境的重要組成成分，不僅與造血干細胞的自我更新、增殖、分化和歸巢現(xiàn)象關系密切，而且對血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、進展和預后產(chǎn)生重要影響。人臍血源基質(zhì)細胞(human stromal cells derived from umbilical cord blood，hUCBDSCs)可促進骨髓

2、造血微環(huán)境損傷的修復，具有取材方便、細胞增殖活性高和免疫原性弱等優(yōu)點。已有研究表明，從人臍血標本中分離的基質(zhì)細胞通過直接接觸促進造血干細胞自我更新、增殖和分化的作用，基質(zhì)細胞可以分泌多種促進造血的細胞因子如TPO、GM-CSF和SCF等，可增強造血干細胞的骨髓遷移和發(fā)育，并可以分泌細胞外基質(zhì)成分(extracellular matrix，ECM)參與造血微環(huán)境的組成。然而，臍帶血來源的基質(zhì)細胞存在數(shù)量有限，且其體外擴增培養(yǎng)必須嚴格依賴于

3、特定的胎牛血清等缺點，這阻礙了人臍血源基質(zhì)細胞的臨床應用。理想的體外培養(yǎng)體系應避免使用動物血清成分帶來臨床應用上的風險。本研究嘗試以人AB型血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)人臍血基質(zhì)細胞，獲得了較好的效果，建立了一種穩(wěn)定的體外培養(yǎng)擴增人臍血基質(zhì)細胞方法，為人臍血基質(zhì)細胞的臨床應用奠定基礎。主要的實驗結果如下： 1.人臍血基質(zhì)細胞生長狀態(tài)的動態(tài)觀察：在培養(yǎng)48～96 h后，可見少數(shù)細胞已貼壁。貼壁細胞呈不規(guī)則形并可見胞漿突起形成，大約1周后貼

4、壁細胞開始出現(xiàn)明顯的分裂增殖，并可見CFU-F集落形成，繼續(xù)培養(yǎng)至CFU-F集落融合形成單層細胞。經(jīng)HE染色觀察，人臍血基質(zhì)細胞呈梭形、圓形或不規(guī)則形，核為圓形或橢圓形，CFU-F集落內(nèi)細胞排列呈放射狀和渦流狀。集落間細胞相互連接、交錯成片。 2.15％人AB型血清和bFGF細胞因子濃度對人臍血基質(zhì)細胞CFU-F的影響：15％人AB型血清能有效支持臍血基質(zhì)細胞在體外的擴增培養(yǎng)。在0～10μg/L范圍內(nèi)bFGF的濃度越高，形成的集

5、落數(shù)也越多，但當其濃度大于10μg/L時，對人臍血基質(zhì)細胞形成集落數(shù)的刺激作用無明顯增加。 3.臍血基質(zhì)細胞表面標志的檢測：應用免疫組化染色，檢測了Vimentin、CD34、TdT、CD45和CK等在臍血基質(zhì)細胞中的表達。生長狀態(tài)良好的第1-2次傳代細胞用于進行免疫組化檢測，結果表明人臍血基質(zhì)細胞的表型為Vimentin(+)、CD34(+)、TdT(一)、CD45(二)和CK(一)。 主要結論：成功建立一種人AB型血