VCAM-1修飾人臍血基質細胞對造血干-祖細胞擴增的實驗研究.pdf

1、造血微環(huán)境(hematopoieticinductivemicroenvironment，HIM)是造血干/祖細胞定殖、分化、發(fā)育和成熟的場所，基質細胞作為造血微環(huán)境中的重要成分，不僅與造血細胞的自我更新、增殖分化及歸巢定位密切相關，而且在血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中也具有非常重要的作用。因此深入探討基質細胞對造血的影響，對血液學的研究和發(fā)展十分重要。目前對基質細胞的研究主要集中在骨髓基質細胞方面，有關臍血基質細胞及臍血相關造血

2、微環(huán)境生物學特性的研究報道較少。臍血中的造血干細胞較外周血和骨髓更原始，具有來源廣泛，采集方便，GVHD輕，高增殖和長期造血重建的特點，具有廣闊的臨床應用前景。本科室前期工作證實，臍血中存在基質細胞的前體細胞，并能通過特定的細胞因子組合使臍血基質細胞得以有效擴增；擴增后的臍血基質細胞能夠分泌表達GM-CSF、TPO、SCF等多種細胞因子。 基于以上分析，本課題擬對臍血基質細胞的生物學特性進行進一步研究；同時構建VCAM-1-pc

3、DNA3.1(+)真核表達載體，并對VCAM-1修飾的人臍血基質細胞調控造血的作用進行初步的探討。 一、本研究的主要內容和研究方法如下：1.應用人臍血CD34+細胞，采用DEXTER基質細胞培養(yǎng)體系行臍血基質細胞培養(yǎng)，采用細胞化學和免疫細胞化學對臍血基質細胞的細胞組成進行進一步鑒定，初步探討臍血基質細胞傳代培養(yǎng)的條件和方法。 2.比較臍血CD34+細胞在細胞因子存在和/或臍血基質細胞支持條件下，體外擴增能力的異同，并對不

4、同條件下擴增的細胞進行CFU-GM、CFU-E、CFU-MG半固體培養(yǎng)，探討臍血基質細胞在造血細胞體外擴增研究中可能的應用價值。 3.采用半巢式RT-PCR從人臍靜脈內皮細胞中獲取VCAM-1基因，并將其定向克隆到PCDNA3.1(+)真核表達載體中，構建VCAM-1-PCDNA3.1(+)真核表達載體。 4.脂質體介導VCAM-1-PCDNA3.1(+)真核表達載體轉染人臍血基質細胞，半定量RT-PCR和免疫細胞化學分

5、別從MRNA和蛋白質水平檢測轉染前/后HUCBSCVCAM-1表達情況。 5.在第一部分實驗的基礎上，增加VCAM-1修飾HUCBSC滋養(yǎng)層組(V組)和細胞因子聯(lián)合VCAM-1修飾HUCBSC滋養(yǎng)層組(F+V組)，比較臍血CD34+細胞在上述條件下體外擴增能力的異同，并對不同條件下擴增的造血細胞進行CFU-GM、CFU-E、CFU-MG半固體培養(yǎng)，初步探討VCAM-1修飾的臍血基質細胞在造血調控方面的作用和意義。 二、實

6、驗結果如下：1.人臍血基質細胞的形態(tài)學特征及鑒定：擴增后的人臍血基質細胞在形態(tài)學上主要包括三種不同類型的細胞成分：①“成纖維樣”細胞；②“巨噬樣”細胞；③“小圓樣”細胞。細胞化學提示糖原強陽性，陽性率100％；堿性磷酸酶部分陽性，陽性率26％。免疫細胞化學顯示：CD68呈強陽性，陽性率93％；CD31陽性率95％；Fn陽性率98％；CD34呈陰性。 2.人臍血基質細胞的傳代培養(yǎng)：本實驗在細胞生長達80％融合時即開始傳代，培養(yǎng)基和

7、培養(yǎng)條件不變，為保證接種細胞密度，采取1：1的比例傳入同等容量的培養(yǎng)瓶中。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞形態(tài)逐漸趨于一致，以“成纖維樣”細胞為主，“小圓樣”細胞和“巨噬樣”細胞明顯減少，成功傳至第4代。 3.人臍血基質細胞促進造血干/祖細胞體外擴增的作用：以hUCBSC為滋養(yǎng)層的擴增體系能夠對臍血CD34+細胞進行有效擴增；其中，以細胞因子聯(lián)合hUCBSC對CD34+細胞的擴增作用最佳(P＜0.05)，短期擴增后的臍血CD34+細胞形

8、成的CFU-GM、CFU-E和CFU-Mg顯著高于未擴增對照組(P＜0.05)。此外，以hUCBSC為滋養(yǎng)層擴增后的臍血CD34+細胞，其CFU-Mg集落的形成能力明顯高于未擴增組和單獨的細胞因子組(P＜0.05)。 4.VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表達載體的構建：采用半巢式RT-PCR法從人臍靜脈內皮細胞HUV-EC-C中分三段克隆得到VCAM-1CDNA片段1、2、3；應用基因重疊延伸技術(SPICEDBYOVE

9、RLAPPINGEXTENSION，SOE)分別將片段1、2連接成片段4，片段2、3連接成片段5，并分別亞克隆至PMD18-T載體中，測序修復后，定向克隆至PCDNA3.1(+)真核表達載體中，構建VCAM-1-PCDNA3.1(+)真核表達載體；測序證實與GENBANK中序列一致，定向構建的VCAM-1-PCDNA3.1(+)真核表達載體連接方向、閱讀框正確，表明載體構建成功。 5.脂質體介導VCAM-1-PCDNA3.1(+

10、)真核表達載體轉染人臍血基質細胞及陽性克隆的鑒定：脂質體介導重組載體轉染原代培養(yǎng)人臍血基質細胞，經G418篩選，7天后可見有陽性克隆形成。與轉染前相比，轉染后的原代培養(yǎng)的HUCBSC呈片狀生長，數(shù)量有所減少，細胞體積稍增大、形態(tài)仍以“成纖維樣”細胞、“巨噬樣”細胞和“小圓樣”細胞為主；陰性對照組經G418篩選后死亡。提取轉染細胞基因組DNA，PCR鑒定NEOR基因存在，證實載體基因已成功轉染至細胞內中。 6.轉染前/后VCAM-

11、1基因在人臍血基質細胞中表達情況的檢測：采用半定量RT-PCR和免疫細胞化學分別從MRNA和蛋白質兩個不同的水平進行檢測。其中，半定量RT-PCR以B-ACTIN作為內參，免疫細胞化學陽性細胞以百分比表示，達到半定量檢測的目的，結果提示轉染后人臍血基質細胞VCAM-1的表達較轉染前明顯增高(P＜0.05)。 7.VCAM-1修飾人臍血基質細胞促進造血干/祖細胞體外擴增的作用：在第一部分實驗的基礎上，增加VCAM-1修飾hUCBS

12、C滋養(yǎng)層組(V組)和細胞因子聯(lián)合VCAM-1修飾hUCBSC滋養(yǎng)層組(F+V組)對造血細胞進行體外擴增，結果顯示VCAM-1修飾的人臍血基質細胞能夠有效支持臍血CD34+細胞的體外擴增(P＜0.01)，其中對CFU-Mg的擴增作用強于未轉染組(S組，P＜0.05)。 三、研究得出以下結論：1.人臍血基質細胞具有造血基質細胞的基本特征； 2.原代培養(yǎng)的人臍血基質細胞可以傳代培養(yǎng)，傳代后細胞形態(tài)趨于一致，以“成纖維樣”細胞為

13、主，在本實驗條件下可傳至第4代； 3.人臍血基質細胞具有促進造血干/祖細胞體外擴增的能力，與細胞因子聯(lián)合促進作用更加明顯，對巨核細胞集落生成的促進作用尤為顯著； 4.本研究構建的VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表達載體可在轉染的人臍血基質細胞中檢測到NeoR基因，并且可使VCAM-1表達增高，表明VCAM-1基因高表達體系構建成功； 5.VCAM-1修飾的人臍血基質細胞對造血干/祖細胞體外擴增具有明顯促進