不同移植次數的骨髓基質干細胞對大鼠脊髓損傷修復的比較.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重威脅人類生命和健康的常見疾病。近年來隨著現代工礦、交通、建筑業(yè)的高速發(fā)展，外傷導致SCI患者數量日漸增多，且多發(fā)生于青壯年人群中。大部分患者因SCI而導致終生殘疾，給社會和家庭帶來沉重的負擔。目前人類還沒有找到對SCI治療的特效方法。現階段仍以穩(wěn)定創(chuàng)傷致不穩(wěn)定的脊柱、解除脊髓壓迫為基礎的手術治療；加之早期使用一些藥物對癥治療及后期的康復訓練。但遺憾的是治療效果一直沒有明顯

2、的提高。近年來，組織工程的飛速發(fā)展及對SCI后的病理改變、機理認識不斷深入，骨髓基質于細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)移植修復重建SCI，取得一定的療效。
　　 BMSCs是骨髓造血系統(tǒng)中的非造血干細胞，具有多項分化潛能，加之又取材方便、擴增迅速、可自體移植、免疫原性低等特點，成為組織工程研究領域理想的種子細胞之一。實驗證明具有很強的增殖能力和多向分化潛能，可分化為骨、軟骨和韌帶、脂肪等多種

3、組織細胞，也有向神經元樣細胞、神經干細胞的分化能力；同時植入體內的BMSCs能夠產生多種神經營養(yǎng)因子，均有助于SCI的恢復。但是實驗發(fā)現分化了的神經元樣細胞及分泌的營養(yǎng)因子隨時間的增加會逐漸減少。受以上因素的啟發(fā)，為探討移植的最佳次數，為將來使用自體移植BMSCs于臨床治療SCI，提供依據。
　　 目的：
　　 1.建立SCI模型，通過蛛網膜下腔置管移植Hoechst33342標記了的BMSCs。
　　 2.觀察

4、多次移植BMSCs在成年大鼠脊髓損傷區(qū)內的遷移、存活、轉歸。
　　 3.觀察分化的神經元樣細胞的存活；表達的巢蛋白(Nestine)及神經絲蛋白(NF-200)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的陽性表達的變化；BBB評分的變化。
　　 4.探討對神經功能修復的可能機理及最佳的移植次數。
　　 方法：
　　 1.我們采用密度梯度分離與細胞貼壁培養(yǎng)相結合的方法獲得同種異體第二代(P2)BMSCs，Hoechst

5、33342標記后，經損傷平面蛛網膜下腔中段放置一硅膠管注入標記的BMSCs。
　　 2.采用改良的Aell's法90只Wistar大鼠進行造模，在T9-10階段，采用打擊勢能10g×9cm，打擊一次，在距離2cm處進行蛛網膜下腔埋管。SCI術后BBB評分，小于4分為納入標準。隨即分5組。A組經蛛網膜下腔置的管移植1次0.1 mL含1×107個/mL BMSCs(術后1W)，B組2次(1、3W)，C組3次(1、3、5W)，D組5次

6、(1、3、5、7、9W)，E組為空白對照。
　　 3.植后1、3、5、7、9、12W評價實驗動物的神經功能狀況，相應時間點用熒光顯微鏡觀察BMSCs在體內遷移、存活以及分化情況。HE染色、SABC免疫組化法檢測Nestin、NF200、GFAP陽性表達情況。
　　 結果:
　　 1.SCI后1W各組BBB評分均低于4分；3W后，各時間點BBB評分E組與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，5W后各時間點

7、，A組評分有提高，但達到一個平臺，功能恢復明顯較C、D組慢，C、D組評分明顯較B、A增加，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。但C、D組在各時間點比較無差異，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2.熒光顯微鏡觀察SCI后3W，移植的BMSCs存活于損傷脊髓損傷區(qū)及周圍，并達到高峰，此后，A組細胞數逐漸減少，B、C、D組和A組一樣，移植后升高，隨后下降，7～12W各時間點，A、B組與C或D組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，但C、

8、D組在各時間點比較無差異，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3.HE示術后3W，損傷的脊髓形成空洞，移植治療后A、B、C、D組空洞逐漸減小，12W時，C組空洞最小，A、B組次之，E組最大，未見明顯變化。
　　 4.1免疫組化顯示NF200陽性細胞的變化趨勢與BMSCs的細胞減少上基本一致，SCI后3W，NF200陽性細胞存活于脊髓損傷區(qū)及周圍，并達到高峰，此后，A組細胞數逐漸減少，B、C、D組和A組一樣，移植后NF2

9、00升高，隨后下降，至12W時，NF200在C組中數量最多，表達最明顯；在A組中可見到少量的NF200細胞，表達最弱；神經元樣細胞發(fā)出的神經絲穿過損傷區(qū)在C組中也最明顯，A組比較少，B組居中。
　　 4.2 E組Nestin陽性細胞在損傷1W后，在室管膜區(qū)、臨近損傷區(qū)出現，3W后基本消失，治療組A組在3W、B組在5W,C、D組在7W后Nestin陽性細胞達到高峰，隨后逐漸消失。
　　 4.3 E組GFAP陽性細胞在損傷1

10、W后達到高峰，主要在損傷區(qū)及臨近的廣泛區(qū)域，后逐漸恢復到正常，7W后空洞邊緣形成膠質瘢痕，A組GFAP陽性細胞在3W時達到高峰，B組在5W，C、D組在7W。至7W后，移植組膠質細胞逐漸重新排列，損傷處的膠質細胞突起之間開始相互編織，細胞肥大。此后，GFAP陽性細胞數逐漸減少，至12W，細胞仍肥大，GFAP陽性細胞間連接形成網狀支架，其間有新生軸突穿過損傷區(qū)，以C組最為明顯，B組次之，A組比較小。
　　 結論：
　　 1.

11、采用密度梯度分離與細胞貼壁相結合的方法培養(yǎng)BMSCs，是一種簡單可行的方法。依據Aellen's改良方法建立的SCI模型是有效的。
　　 2.多次移植有利于提高損傷局部的BMSCs濃度，改善局部的微環(huán)境。移植3次組較其他組獲得更好的功能恢復。
　　 3.免疫組化顯示移植的BMSCs可以分化為神經前體細胞及神經元樣細胞，相應的表達Nestin和NF200陽性。3次移植轉化最多的神經元樣細胞，發(fā)出神經絲穿過損傷區(qū)，修復損傷。