人臍血源基質(zhì)細胞新型微環(huán)境對殘留白血病細胞的作用及機制探討.pdf

1、殘留白血病細胞或稱白血病微小殘留病(minimal residual disease； MRD)是白血病治療達到完全緩解后體內(nèi)殘留的白血病細胞，多處于GO期，對化療藥物不敏感，是白血病難治、復發(fā)的主要根源。目前，尚未發(fā)現(xiàn)真正的白血病細胞特異性抗原，雖然采用多種方法聯(lián)合但均不能滿意殺滅和有效清除患者體內(nèi)的MRD，而且采用化療新藥和更強烈的聯(lián)合化療方案多對正常造血功能造成嚴重的損傷。針對MRD，目前尚缺乏有效低毒的清除措施，已成為嚴重束縛白

2、血病治療取得突破性進展的關(guān)鍵性障礙之一。探索不同來源基質(zhì)細胞所構(gòu)建造血微環(huán)境對MRD的作用及機制，對進一步降低白血病復發(fā)、提高白血病長期生存率，具有重要的理論和實踐意義。 造血微環(huán)境( hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是調(diào)控造血干/祖細胞生長發(fā)育的“土壤”，骨髓基質(zhì)細胞( bone marrow stromal cells，BMSCs)是構(gòu)成造血微環(huán)境的重要成分。白血病細

3、胞是惡性克隆性增殖的造血細胞，其生存、分化、增殖同樣依賴HIM的調(diào)控，白血病骨髓基質(zhì)細胞微環(huán)境有助于白血病細胞的庇護、生長和逃避化療藥物的殺傷，是MRD產(chǎn)生的重要機制之一，因此從造血微環(huán)境入手探索清除MRD的有效方法是白血病治療的新的切入點。 本課題組的既往研究證實：在適當?shù)募毎蜃咏M合的條件下，可成功培養(yǎng)、擴增人臍血來源的基質(zhì)細胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells

4、，hUCBDSCs)；擴增后的hUCBDSCs在細胞組成和免疫表型上與人骨髓基質(zhì)細胞(human bone marrowstromal cells，hBMSCs)相似，可以分泌多種細胞因子，具有與hBMSCs相似的支持和重建造血功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，可稱為人臍血源基質(zhì)細胞造血微環(huán)境( hematopoieticinductive microenvlronment from human umbilical cord blood-derived

5、stromal cells,hUCBDSC-HIM)。 人急性T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat細胞分別與hUCBDSC-HIM和正常人骨髓基質(zhì)細胞造血微環(huán)境( hBMSC-HIM)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：hUCBDSC-HIM具有較hBMSC-HIM對Jurkat細胞更強的抑制作用和促凋亡作用。 鑒于此，本實驗將系統(tǒng)、深入地研究不同來源基質(zhì)細胞所模擬造血微環(huán)境對殘留耐藥Jurkat細胞的細胞周期分布、增殖、分化、凋亡及藥物敏感性等

6、生物學特性的影響，并對其機制進行初步探討。 研究內(nèi)容及方法： 1.不同來源骨髓基質(zhì)細胞微環(huán)境對Jurkat細胞生物學特性的影響 實驗分組：①Jurkat細胞懸浮培養(yǎng)組；②Jurkat細胞/正常hBMSCs共培養(yǎng)組；③Jurkat細胞/白血病hBMSCs共培養(yǎng)組。 倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察Jurkat細胞與BMSCs的位相關(guān)系；MTT法檢測Jurkat細胞的黏附率；Transwell法檢測Jurkat細胞遷

7、移侵襲功能變化；CCK-8法、Real-timeQ-PCR法、Western blot法檢測Jurkat細胞增殖特性的變化；流式細胞儀法檢測Jurkat細胞周期及DNR攝藥量變化；流式細胞儀法、透射電鏡、Real-time Q-PCR法、Western blot法檢測Jurkat細胞的凋亡；NBT還原法檢測Jurkat細胞分化水平變化。 2.殘留耐藥Jurkat細胞的培養(yǎng)及其耐藥機制的初步探討 體外分離培養(yǎng)初發(fā)急性淋巴細

8、胞白血病患者BMSCs以模擬骨髓造血微環(huán)境，在與Jurkat細胞長期共培養(yǎng)的過程中選用含DNR50ng/ml的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時間的延長，絕大部分Jurkat細胞漂浮死亡。極少數(shù)殘留的Jurkat細胞逐漸恢復活力并獲得抗藥能力，可以在DNR終濃度為50ng/ml的培養(yǎng)液中存活、增殖，將該細胞記為JurkaUDNR細胞。 CCK-8法檢測Jurkat及Jurkat/DNR細胞的增殖特性及對多種化療藥物的耐藥系數(shù)；流式細胞

9、儀法檢測Jurkat及Jurkat/DNR細胞周期及DNR攝藥量；通過檢測Caspase-Glo3/7活性、Real-time Q-PCR法、Westem blot法檢測Jurkat及Jurkat/DNR細胞的凋亡相關(guān)指標；Real-time Q-PCR法檢測Jurkat及Jurkat/DNR細胞多藥耐藥相關(guān)基因：MDR1及MRP mRNA的表達。 3.人臍血源基質(zhì)細胞對殘留耐藥Jurkat細胞的作用 實驗分組：①Jur

10、kat/DNR細胞懸浮培養(yǎng)組；②Jurkat/DNR細胞/JF.常hBMSCs共培養(yǎng)組；③Jurkat/DNR細胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)組；④Jurkat/DNR細胞/白血病hBMSCs共培養(yǎng)組(僅在檢測對IDA敏感性時設(shè)定)。 收集懸浮培養(yǎng)及共培養(yǎng)10d的Jurkat/DNR細胞，檢測其增殖、細胞周期分布、凋亡、分化、對IDA藥物敏感性及多藥耐藥基因MRDl mRNA表達水平的變化。 結(jié)果： 1.倒置顯微鏡及

11、掃描電鏡觀察：隨培養(yǎng)時間延長，正常hBMSCs及白血病hBMSCs黏附、龕合、包裹Jurkat細胞，對共培養(yǎng)的Jurkat細胞具有一定的屏蔽作用，在一定程度上影響其生物學特性： 1.1黏附、遷移作用：白血病hBMSCs對Jurkat細胞的黏附、趨化作用強于正常hBMSCs； 1.2增殖曲線：正常hBMSCs對Jurkat細胞的增殖抑制作用強于白血病hBMSCs； 1.3細胞周期分布：白血病hBMSCs共培養(yǎng)組Ju

12、rkat細胞GO/G1+G2/M期細胞比例明顯增高；正常hBMSCs共培養(yǎng)組S+G2/M期細胞比例明顯增高； 1.4凋亡：白血病hBMSCs抑制Jurkat細胞凋亡，而正常hBMSCs促Jurkat細胞凋亡； 1.5細胞分化：白血病hBMSCs對共培養(yǎng)Jurkat細胞的促分化作用弱于正常hBMSCs； 1.6對DNR的攝藥量：共培養(yǎng)組Jurkat細胞的攝藥量顯著低于懸浮培養(yǎng)組，其中白血病hBMSCs共培養(yǎng)組Jur

13、kat細胞的攝藥量最低。 2嵌合于基質(zhì)細胞層中的Jurkat細胞在DNR的持續(xù)刺激作用下逐步產(chǎn)生耐藥性，獲得殘留耐DNR的Jurkat細胞。 Jurkat/DNR細胞與Jurkat細胞相比有以下特點： 2.1增殖曲線：Jurkat/DNR細胞較Jurkat細胞的增殖速度明顯減緩 2.2細胞周期分布：GO/G1期細胞比例增高；異二倍體細胞比例增高； 2.3凋亡：發(fā)生自發(fā)凋亡的細胞明顯減少；

14、 2.4 DNR攝藥量：單個Jurkat/DNR細胞內(nèi)平均藥物濃度明顯減低； 2.5對多種化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥； 2.6多藥耐藥相關(guān)基因：Jurkat/DNR細胞內(nèi)可檢測到MDRl mRNA表達；MRPmRNA表達水平升高。 3.人臍血源基質(zhì)細胞對殘留耐藥Jurkat/DNR細胞的作用 3.1增殖曲線：hUCBDSCs對Jurkat/DNR細胞的增殖抑制作用強于正常hBMSCs； 3.2細胞周期分

15、布：hUCBDSCs及正常hBMSCs均可促Jurkat/DNR細胞進入細胞周期，hUCBDSCs共培養(yǎng)組GO/G1期細胞比例最低；共培養(yǎng)組Jurkat/DNR細胞中異二倍體比例顯著降低； 3.3凋亡和分化：hUCBDSCs對共培養(yǎng)Jurkat/DNR細胞自發(fā)凋亡及分化的促進作用均強于正常hBMSCs； 3.4對IDA的敏感性：hUCBDSCs及hBMSCs均可提高Jurkat/DNR對IDA的敏感性，而hUCBDSCs

16、要優(yōu)于hBMSCs； 3.5 MDR1 mRNA的表達：共培養(yǎng)組Jurkat/DNR細胞MDRl mRNA表達水平低于懸浮培養(yǎng)組，其中hUCBDSCs共培養(yǎng)組的表達水平最低。 結(jié)論： 1.白血病骨髓基質(zhì)細胞微環(huán)境有助于白血病細胞的庇護、生長和逃避化療藥物的殺傷；正常骨髓源基質(zhì)細胞較白血病源骨髓基質(zhì)細胞對Jurkat細胞具有更強的促凋亡、分化及抑制增殖的作用。同時，正常hBMSCs可以增加Jurkat細胞對DNR的