ALK5與ERK1-2通路在TGF-β1誘導(dǎo)銀屑病成纖維細(xì)胞與正常人成纖維細(xì)胞表達(dá)CCN2的研究.pdf

1、研究背景:
　　 銀屑病是一種以表皮過度增殖為主要病理特征的慢性炎癥性皮膚病。臨床特點(diǎn)為境界清楚的覆有鱗屑的紅斑，銀屑病斑塊的病理改變主要在表皮層，表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生，角化不全。然而，早在20年前，就有研究人員指出，銀屑病累及的是皮膚全層，而并非只是角質(zhì)形成細(xì)胞。已有研究表明，在銀屑病皮損區(qū)和非皮損區(qū)成纖維細(xì)胞的刺激下，正常表皮會處于過度增生狀態(tài)。那么，銀屑病皮膚功能缺失的深層原因是否在于成纖維細(xì)胞？
　　 轉(zhuǎn)化

2、生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是多功能細(xì)胞因子超家族成員之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)蛋白合成中起重要作用。眾多研究表明，銀屑病患者的皮損及血清中TGF-β1表達(dá)水平存在異常。既往對TGF-β1參與銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究，多集中于TGF-β1對角質(zhì)形成細(xì)胞的抑制作用，我們則認(rèn)為，TGF-β1還可以顯著激活銀屑病皮損成纖

3、維細(xì)胞，刺激成纖維細(xì)胞分泌和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)的合成。TGF-β1誘導(dǎo)的銀屑病真皮中異常的成纖維細(xì)胞可能是銀屑病發(fā)病的始動因素之一。
　　 目的:
　　 明確TGF-β1對銀屑病皮損區(qū)成纖維細(xì)胞和正常人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白CCN2，F(xiàn)N，typeⅠ collagen及間充質(zhì)蛋白N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表達(dá)的作用，重點(diǎn)研究不同調(diào)控因子（ALK5通路抑制劑與ERK1/2通

4、路抑制劑）對TGF-β1誘導(dǎo)銀屑病及正常人真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)ECM及Smad1，Smad2，ERK1/2磷酸化的影響，探究其涉及的細(xì)胞通路。
　　 方法:
　　 活檢皮膚，分離、培養(yǎng)銀屑病皮損區(qū)及正常真皮成纖維細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)。以Western Blot法檢測TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)CCN2，ECM蛋白(FN、typeⅠ collagen)及間充質(zhì)蛋白N-cadherin、Vimentin、β-catenin的作

5、用，及磷酸化蛋白p-Smad1，p-Smad2，p-ERK1/2表達(dá)的作用，以ALK5通路抑制劑SB431542和ERK1/2通路抑制劑U0126阻斷相應(yīng)細(xì)胞通路，了解影響銀屑病成纖維細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)CCN2及ECM蛋白表達(dá)的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 一.TGF-β1對正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞表達(dá)CCN2、及FN、typeⅠ collagen等ECM蛋白的影響。
　　 1.正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞中，

6、在TGF-β1的作用下，CCN2的表達(dá)顯著增加;
　　 2.正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞中，在TGF-β1的作用下，ECM蛋白(Fibronectin，typeⅠ collagen)表達(dá)顯著增加。
　　 3.在TGF-β1的作用下，正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞間充質(zhì)蛋白N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表達(dá)顯著增加。
　　 二.TGF-β1對正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞中TGF-β/Smads通路中

7、Smads蛋白及MAPK通路中ERK1/2蛋白的磷酸化的影響。
　　 1.在正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞中，TGF-β1的作用下，TGF-β/Smads通路中Smads蛋白的磷酸化增加，即磷酸化蛋白p-Smad1，p-Smad2的顯著表達(dá)增加。
　　 2.在TGF-β1的作用下，正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞中MAPK通路中ERK1/2蛋白的磷酸化增強(qiáng)，即磷酸化蛋白p-ERK1/2表達(dá)顯著增加。
　　 三.ALK5通路抑制

8、劑SB431542對TGF-β1誘導(dǎo)正常人與銀屑病成纖維細(xì)胞表達(dá)CCN2、FN、typeⅠ collagen、N-cadherin、Vimentin、β-catenin蛋白的影響。
　　 1.加入ALK5通路抑制劑SB431542作用后，正常人與銀屑病成纖維細(xì)胞表達(dá)CCN2，F(xiàn)N，typeⅠ collagen顯著降低。
　　 2.加入ALK5通路抑制劑后，正常人與銀屑病成纖維細(xì)胞表達(dá)N-cadherin、β-cateni

9、n顯著減少，但Vimentin的表達(dá)無明顯變化。
　　 四.ERK1/2通路抑制劑U0126對TGF-β1誘導(dǎo)正常人與銀屑病成纖維細(xì)胞表達(dá)CCN2、FN、typeⅠ collagen、 N-cadherin、 Vimentin、β-catenin蛋白的影響。
　　 1.在正常人與銀屑病成纖維細(xì)胞中，加入ERK1/2通路抑制劑U0126后，CCN2，F(xiàn)N，typeⅠ collagen的表達(dá)略微降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

10、　　 2.在正常人與銀屑病成纖維細(xì)胞中，加入ERK1/2通路抑制劑U0126后，Vimentin的表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而N-cadherin、β-catenin的表達(dá)略微降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 五.ALK5通路抑制劑SB431542和ERK1/2通路抑制劑U0126對TGF-β1誘導(dǎo)Smads蛋白及ERK1/2磷酸化的影響
　　 1.TGF-β1可以顯著誘導(dǎo)p-Smad1，p-Smad2，p-ERK

11、1/2表達(dá)顯著增加，在正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞中，使用SB431542阻斷ALK5通路后，磷酸化蛋白p-Smad1，p-Smad2的表達(dá)明顯降低;SB431542對p-ERK1/2的表達(dá)的無明顯影響。
　　 2.相反地，使用U0126阻斷ERK1/2通路對p-Smad1,p-Smad2的表達(dá)無影響，但U0126顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的p-ERK1/2的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.TGF-β1可以顯著誘導(dǎo)正常

12、人及銀屑病成纖維細(xì)胞CCN2，F(xiàn)N，typeⅠ collagen表達(dá)的增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.TGF-β1可以顯著誘導(dǎo)正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)蛋白N-cadherin、Vimentin、β-catenin增加。
　　 3.TGF-β1可以激活正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞中的TGF-β/Smads通路，促使磷酸化蛋白p-Smad1，p-Smad2的表達(dá)增加。
　　 4.TGF-β1可以激活正常人

13、及銀屑病成纖維細(xì)胞中的MAPK通路中ERK1/2通路，使磷酸化蛋白p-ERK1/2的表達(dá)增加。
　　 5.ALK5通路抑制劑SB431542顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CCN2等ECM蛋白的表達(dá)，而ERK1/2通路抑制劑U0126雖然能使ECM蛋白的表達(dá)略微下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6.SB431542顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的磷酸化蛋白p-Smad1，p-Smad2的表達(dá)，而U0126則作用不明顯。
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14、.U0126顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)p-ERK1/2的表達(dá)，而SB431542則無明顯作用。8.銀屑病成纖維細(xì)胞表達(dá)CCN2、 Fibronectin、typeⅠ collagen、 N-cadherin、Vimentin、β-catenin比正常人成纖維細(xì)胞增高，但差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 9.ALK5通路在TGF-β1誘導(dǎo)正常人及銀屑病成纖維細(xì)胞表達(dá)CCN2、Fibronectin、typeⅠ collagen、N-